大鼠血管平滑肌增殖器官模型的機(jī)制探討.pdf

1、研究目的：探討大鼠動(dòng)脈在體外培養(yǎng)條件下其血管平滑肌細(xì)胞增殖的形成機(jī)制，為本室已建立的血管平滑肌增殖器官模型的應(yīng)用提供理論依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法： 實(shí)驗(yàn)分組：在無(wú)菌條件下取大鼠腹主動(dòng)脈，剪成1.5cm左右小段，實(shí)驗(yàn)分成：20％FBS培養(yǎng)(其中又分為：內(nèi)皮損傷、損傷+BQ123、未損傷、未損傷+BQ123四個(gè)組)和無(wú)血清培養(yǎng)(其中也分為：內(nèi)皮損傷、損傷+BQ123、未損傷、未損傷+BQ123四個(gè)組)共8個(gè)實(shí)驗(yàn)組。每組10個(gè)血管條，

2、分兩個(gè)培養(yǎng)瓶在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)10d，每隔24h半量換液一次。其中一瓶于培養(yǎng)第5天時(shí)加入5-Brdu(8x 10<'-4>mol/l)標(biāo)記，收集后用4％多聚甲醛固定，作石蠟切片用于HE染色和免疫組織化學(xué)染色。另一瓶用于提取總RNA做RT-PCR。收集每組培養(yǎng)上清貯存于-80℃，用于檢測(cè)ET-1。正常對(duì)照組用未培養(yǎng)的血管。 免疫組織化學(xué)染色：每組5個(gè)血管條各取2張切片做免疫組織化學(xué)，具體步驟如下：將切片脫蠟至水后，用含0.3％

3、雙氧水的甲醇封閉；2N鹽酸37℃ 1h；正常羊血清封閉20 min，以上各步之間用0.1M PBS沖洗3次。5-BrDU抗體(1：250)4℃過(guò)夜；二抗(1：50)37℃ 30 min；SABC 37℃ 20 min；DAB顯色3 min，以上各步之間用0.1M PBS沖洗3次。脫水，二甲苯透明，封片，顯微鏡下觀察。每張切片都進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，每組陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞以X±表示，用t檢驗(yàn)顯著性差異。 上清液中ET-1的測(cè)定：將上述收集的

4、培養(yǎng)上清液，使用放射免疫試劑盒和放免檢測(cè)儀，按照說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定各組樣品中的內(nèi)皮素含量。每一實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果以X±表示，組間用t檢驗(yàn)顯著性差異。 RT-PCR檢測(cè)：將上述實(shí)驗(yàn)收集的血管用一步法(Trizol試劑)提取總RNA，在20μl反應(yīng)體系中42℃ 50 min，70℃ 15 min，逆轉(zhuǎn)錄mRNA為cDNA。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3ul加入聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)體系，在50μl反應(yīng)

5、體系中進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。聚合酶鏈反應(yīng)：94℃變性50 s，56℃退火50 s，72℃延伸1 min，共32個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行分析，同一實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 結(jié)果： 1．血管平滑肌細(xì)胞的增殖： (1)HE染色可見(jiàn)，內(nèi)皮損傷血管經(jīng)體外培養(yǎng)10天后平滑肌細(xì)胞明顯增生，肌纖維排列紊亂。(2)抗5-Brdu免疫組織化學(xué)染色顯示，各組培養(yǎng)血管中膜均有標(biāo)記的平滑肌增殖細(xì)胞，但內(nèi)皮損傷后用20％血清培養(yǎng)組標(biāo)記的增殖細(xì)胞明顯多于無(wú)血

6、清培養(yǎng)組，在培養(yǎng)基中加入內(nèi)皮素受體阻斷劑BQ123能明顯抑制血管平滑肌的增殖(P<0．05)。(3)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，血管平滑肌增殖負(fù)調(diào)控基因Hrg-1在正常血管平滑肌中都有表達(dá)，而各組內(nèi)皮損傷后體外培養(yǎng)10天的血管表達(dá)均明顯減弱，血清培養(yǎng)組更為顯著，加ET-1特異性阻斷劑BQ123后各組表達(dá)均明顯上調(diào)。這說(shuō)明ET-1分泌及血清刺激對(duì)內(nèi)皮損傷后體外培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞增殖起了重要作用。 2．血管平滑肌表型的轉(zhuǎn)化：RT-PCR

7、檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，血管平滑肌收縮表型標(biāo)志基因SM22a在正常血管平滑肌中都有表達(dá)，但在內(nèi)皮損傷后體外培養(yǎng)10天的血管表達(dá)明顯減弱，其中血清培養(yǎng)組血管基本不表達(dá)，加內(nèi)皮素受體阻斷劑BQ123后，各組SM22a的表達(dá)均有所上調(diào)，這表明內(nèi)皮素分泌和血清培養(yǎng)促進(jìn)了血管平滑肌的表型由收縮型向分泌型的轉(zhuǎn)化。 3．培養(yǎng)上清中ET-1的變化：內(nèi)皮損傷后血管ET-1分泌增加，其中血清培養(yǎng)組增加更為顯著(P<0．01)，加入ET-1受體阻斷劑BQ123后，