大鼠血管平滑肌增殖器官和細胞模型的建立.pdf

1、研究目的：為了建立血管平滑肌增殖模型，通過體外培養(yǎng)大鼠主動脈和用體外培養(yǎng)血管再傳代培養(yǎng)血管平滑肌細胞(VascularSmoothMuscleCelI,VSMC)方法，采用5．溴脫氧尿嘧啶核苷(Bromodeoxyuridine，5-BrdU)標記增殖細胞并檢測與血管平滑肌細胞增殖和表型轉化相關的基因高血壓相關基因．1(Hypertension-RelatedGene-1，HRG-1)和平滑肌22Q(SmoothMuscle22alph

2、a，SM22α)，探討一種較為理想的血管平滑肌增殖的器官和細胞模型，為血管平滑肌增殖性疾病的研究提供一個實驗平臺。 實驗方法：器官模型用成年雄性SD大鼠19只，體重150-200g，用水合氯醛麻醉動物，取主動脈放入Hanks液中去除周圍多余的脂肪組織和外周組織，剪成1．5cm左右小段，用竹簽損傷內皮，分成培養(yǎng)5天、8天和13天3個實驗組，在含20％胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，2-3天半量換液一次。正常對照組用未培養(yǎng)的血管，收集

3、血管前24小時用BrdU標記。細胞模型用體外培養(yǎng)8天的血管和正常未培養(yǎng)的血管，用貼塊法分別培養(yǎng)平滑肌細胞。用第3-4代細胞做實驗，在收集細胞前24小時用BrdU標記。以上實驗用HE染色和抗5-BrdU免疫細胞化學染色觀察細胞增殖，用透射電鏡觀察血管平滑肌細胞的亞細胞結構變化；RT-PCR檢測與血管平滑肌增殖相關基因HRG-1和表型標志基因SM22α的表達。 結果：器官模型：體外培養(yǎng)5天、8天、13天的大鼠主動脈用HE染色可見到不

4、同程度的平滑肌細胞增生，第13天組的血管有明顯斑塊形成，突向管腔。BrdU標記的免疫細胞化學結果進一步表明：體外培養(yǎng)的主動脈血管可見標記的增殖平滑肌細胞，且隨著培養(yǎng)天數增多標記細胞也增多，透射電鏡觀察到體外培養(yǎng)8天的血管平滑肌細胞與對照組相比，胞漿中肌絲減少，內質網明顯增多，并可見大量的分泌小泡。RT-PCR結果表明正常血管平滑肌都表達HRG-1和SM22αmRNA，隨體外培養(yǎng)時間延長表達逐漸減少，至培養(yǎng)第13天基本完全消失。提示：體外

5、培養(yǎng)血管可使平滑肌表型從收縮型向分泌型轉化，并有平滑肌增殖。細胞模型：用體外先培養(yǎng)8天的血管傳代培養(yǎng)的平滑肌與正常血管(未培養(yǎng))傳代培養(yǎng)的平滑肌細胞相比，BrdU標記增生細胞明顯增多，RT-PCR結果顯示：正常血管傳代培養(yǎng)的平滑肌HRG-1和SM22αmRNA均有表達，而體外先培養(yǎng)8天后血管再傳代培養(yǎng)的平滑肌HRG-1和SM22α呈極低表達或無表達。提示：用體外先培養(yǎng)一段時間后再傳代培養(yǎng)出來的血管平滑肌作為血管平滑肌增殖細胞模型更趨于血

6、管平滑肌增生性疾病的病理狀態(tài)。 結論：1、體外培養(yǎng)大鼠主動脈可誘導血管平滑肌細胞異常增生，并且表型從收縮型向合成型轉化，這些變化符合動脈粥樣硬化和血管再狹窄等疾病的病理變化。2．、用體外先培養(yǎng)一段時間后血管再傳代培養(yǎng)出來的血管平滑肌作為血管平滑肌增殖細胞模型更趨于血管平滑肌增生性疾病的病理狀態(tài)。3、本文首次建立了用體外培養(yǎng)血管復制平滑肌增殖器官模型的實驗，并改進了原有建立血管平滑肌增殖的細胞模型方法。這兩個模型為體外研究平滑肌細