AGEs致血管平滑肌細胞增殖與NHE1活化的關(guān)系及機制探討.pdf

1、目的：本研究以外源性AGEs為損傷因子，在體外培養(yǎng)的大鼠VSMCs和在體大鼠頸動脈球囊損傷模型上，觀察NHE1選擇性抑制劑cariporide對AGEs誘導(dǎo)的VSMCs增殖和球囊損傷后內(nèi)膜增生的影響，旨在探討AGEs促VSMCs增殖的細胞內(nèi)信號機制。 方法：(1)體外培養(yǎng)的VSMCs實驗：采用組織貼塊法原代培養(yǎng)大鼠VSMCs，用MTT比色法所測得的細胞吸光度值及考馬斯亮藍法測得的細胞總蛋白含量來反映細胞增殖情況，利用BCECF及

2、Fura-2熒光染料通過熒光分光光度計分別檢測NHE1活性、細胞內(nèi)的pH值及[Ca2+]；濃度，RT-PCR檢測NHE1 mRNA表達量。(2)在體動物實驗：用球囊損傷大鼠頸總動脈造模，取標(biāo)本，HE染色，進行形態(tài)學(xué)觀察，并應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析計算內(nèi)膜面積，中膜面積及內(nèi)膜/中膜面積比。 結(jié)果： VSMCs實驗：(1)不同濃度的AGEs(1，5，10，15μg/ml)與VSMCs共孵育24h后，細胞MTT光吸收值及總

3、蛋白水平與正常對照組相比明顯升高(P<0.05或P<0.01)，AGEs濃度為10μg/ml時作用最明顯，說明AGEs可以刺激體外的VSMCs增殖；(2)Cariporide呈濃度依賴性的抑制AGEs誘導(dǎo)的平滑肌細胞的增殖，同時AGEs受體阻滯劑anti-RAGE(5μg/ml)和MAPK特異性抑制劑PD98059(25μmaol/L)亦能明顯地抑制由AGEs誘導(dǎo)的細胞吸光度值和總蛋白濃度的升高；(3)AGEs可以顯著增高細胞內(nèi)Ca2+

4、水平，預(yù)先使用cariporide、anti-RAGE、PD98059均可以顯著抑制由AGEs誘導(dǎo)的細胞內(nèi)Ca2+水平的升高；(4)AGEs刺激后可以引起細胞內(nèi)pH值升高，與正常對照組比，差異顯著(P<0.01)。加入cariporide預(yù)處理后，cariporide能明顯抑制AGEs引起的pH值升高；(5)AGEs濃度依賴性的增強NHE1的活性，預(yù)先使用anti-RAGE，PD98059，轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素-D 10nmol/L和蛋白

5、合成抑制劑放線菌酮10μmol/L均能顯著抑制AGEs誘導(dǎo)的NHE1的活性升高；RT-PCR結(jié)果顯示AGEs可以促進NHE1的mRNA表達增多，與正常組比較有顯著性差異。在體動物實驗：(1)正常血管腔內(nèi)膜可見一層扁平的內(nèi)皮細胞覆蓋，血管各層分界清楚，未見新生內(nèi)膜增殖。單純球囊損傷后，可見血管腔內(nèi)新生內(nèi)膜增生明顯，血管腔狹窄；(2)單純AGEs注射未見大鼠血管內(nèi)膜增生，球囊損傷后，內(nèi)膜明顯增生，與正常血管球囊損傷后的新生內(nèi)膜相比有顯著性差

6、異(0.912±0.024mm2 VS 0.334±0.014mm2，P<0.01)，中膜面積無明顯差異(P>0.05)，此結(jié)果說明AGEs能加速球囊損傷后新內(nèi)膜的形成。(3)給予cariporide(0.1、10 mg/kg)治療后能明顯減少AGEs損傷組新生內(nèi)膜的面積(P<0.01)。 結(jié)論：1 AGEs能明顯促進VSMCs的增殖和血管內(nèi)膜損傷后新內(nèi)膜的形成；2 Cariporide能顯著抑制AGEs誘導(dǎo)的VSMCs的增殖和