白藜三醇結(jié)合蛋白與血管平滑肌細(xì)胞增殖關(guān)系的研究.pdf

1、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)是當(dāng)今威脅人類健康的重要疾病之一。經(jīng)皮冠狀動脈介入治療是目前治療冠心病的重要手段，但是較高的術(shù)后再狹窄的發(fā)生率(15～20％)，成為急需解決的臨床問題。大量基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的遷移、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌是動脈粥樣硬化斑塊形成和再狹窄發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。因此，要預(yù)防冠心病的發(fā)生、減少介入治療術(shù)后再狹窄的發(fā)生率，發(fā)掘能抑制靶部位平滑肌細(xì)胞增生的新藥物并闡明其作用機(jī)制非常重要。 迄今

2、為止，諸多研究均提示白藜三醇是一種具有心血管保護(hù)作用的多酚類化合物。其中一個重要的機(jī)制是白藜三醇可通過抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖來減少血管再狹窄的形成。根據(jù)白藜三醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，有學(xué)者設(shè)計(jì)了白藜三醇親和層析柱，并應(yīng)用該裝置分離、純化了白藜三醇結(jié)合蛋白(RTP)。該蛋白經(jīng)放射配基自顯影法證實(shí)可與白藜三醇特異性結(jié)合，而用質(zhì)譜分析該蛋白的氨基酸序列則證實(shí)其與醌氧化還原酶2(NQO2)有80％的同源性。 白藜三醇是否直接作用于RTP而產(chǎn)

3、生抑制平滑肌細(xì)胞增殖和血管內(nèi)膜增生的保護(hù)作用?RTP又是如何調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞增殖的?這些問題目前都還沒有答案，需要我們?nèi)ヌ剿餮芯俊?目的：本課題擬研究以下問題：(1)分離、純化血管平滑肌組織中的RTP，觀察RTP和NQO2的關(guān)系；(2)白藜三醇對實(shí)驗(yàn)性動脈粥樣硬化再狹窄形成的影響及對血管壁RTP表達(dá)的調(diào)控；(3)白藜三醇對血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響及對胞漿內(nèi)RTP表達(dá)的調(diào)控；(4)RTP高表達(dá)和低表達(dá)對血管平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)控。

4、通過上述研究，從在體、細(xì)胞和分子三個層面來探討白藜三醇對RTP表達(dá)的影響及RTP對血管平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制，為今后白藜三醇作為冠心病血管再狹窄新的靶向治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù). 方法： 1.制備白藜三醇親和層析柱，并從兔主動脈平滑肌組織中分離、純化RTP，采用蛋白質(zhì)電泳及western blot進(jìn)行鑒定； 2.雄性新西蘭大白兔48只，隨機(jī)分為3組，分別按以下條件喂養(yǎng)：(1)普通顆粒狀兔飼料，(2)高膽固醇飼料，

5、(3)高膽固醇飼料+白藜三醇。喂養(yǎng)12周后，部分實(shí)驗(yàn)動物行右側(cè)髂動脈球囊損傷制備再狹窄模型。繼續(xù)喂養(yǎng)4周后，處死所有實(shí)驗(yàn)動物，進(jìn)行以下檢查：(1)血管再狹窄檢查：雙側(cè)髂動脈對應(yīng)部位切片、H-E染色，用Leica Qwin顯微圖像分析軟件測量狹窄率和內(nèi)膜中膜面積比；(2)用Real-time PCR檢測雙側(cè)髂動脈壁RTPmRNA表達(dá)水平的改變；(3)用western blot檢測雙側(cè)髂動脈壁RTP蛋白表達(dá)水平的改變。 3.培養(yǎng)兔血

6、管平滑肌細(xì)胞并用不同濃度(1、10和50μmol/L)白藜三醇干預(yù)不同時間(24、48和72小時)，進(jìn)行以下檢查：(1)用細(xì)胞計(jì)數(shù)方法觀察白藜三醇對平滑肌細(xì)胞增殖的影響；(2)用Reall-time PCR檢測白藜三醇對血管平滑肌細(xì)胞中RTP mRNA表達(dá)水平的影響；(3)用westem blot檢測白藜三醇對血管平滑肌細(xì)胞中RTP蛋白表達(dá)水平的影響。 4.構(gòu)建RTP的真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染大鼠血管平滑肌細(xì)胞，進(jìn)行以下檢測：(1)用

7、半定量RT-PCR和western blot檢測轉(zhuǎn)染后平滑肌細(xì)胞中RTP的表達(dá)；(2)用BrdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒檢測轉(zhuǎn)染后平滑肌細(xì)胞增殖能力的改變。 5.構(gòu)建RTP的RNA干擾慢病毒載體并轉(zhuǎn)染大鼠血管平滑肌細(xì)胞，進(jìn)行以下檢測：(1)用real-time PCR和western blot檢測轉(zhuǎn)染后平滑肌細(xì)胞中RTP的表達(dá)；(2)用BrdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒檢測轉(zhuǎn)染后平滑肌細(xì)胞增殖能力的改變。 結(jié)果： 1.利用白藜

8、三醇親和層析柱可從兔血管平滑肌組織中分離、純化一個分子量約為26kD的蛋白質(zhì)，將其命名為RTP-26。該蛋白質(zhì)的分子量與文獻(xiàn)記載的NQO2分子量一致，并且在用RTP多克隆抗體，即NQO2抗體進(jìn)行western blot時可以檢測到該蛋白。 2.在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示白藜三醇能夠抑制動脈粥樣硬化再狹窄的形成。對照組、動脈粥樣硬化模型組和白藜三醇治療組的血管狹窄率分別為：63.04±3.33％.73.92士7.10％和28.10±5.83

9、％(三組間ANOVA檢驗(yàn)，P<0.01)。 髂動脈壁RTP-26的mRNA和蛋白表達(dá)水平：白藜三醇明顯抑制了RTP-26的表達(dá)，mRNA表達(dá)較對照組降低了39％較模型組降低了44％(三組間ANOVA檢驗(yàn)，P<0.01)；蛋白表達(dá)較對照組降低了35％較模型組降低了32％(三組間 ANOVA檢驗(yàn)，P<0.01). 3.在細(xì)胞水平的研究發(fā)現(xiàn)：(1)白藜三醇能夠抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖，且具有濃度依賴和時間依賴的特點(diǎn)。(2)白藜

10、三醇抑制平滑肌細(xì)胞內(nèi)的RrP-26 mRNA表達(dá)。1、10和50μmol/L白藜三醇干預(yù)平滑肌細(xì)胞72小時，細(xì)胞內(nèi)RTP-26 mRNA的表達(dá)分別降低了56％、62％和95％，與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。50μmol/L白藜三醇干預(yù)平滑肌細(xì)胞的時間達(dá)到48和72小時時，細(xì)胞內(nèi)RTP-26 mRNA的表達(dá)分別降低了53％和95％，與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。(3)RTP-26蛋白的表達(dá)也明顯降低。10和50μm

11、ol/L白藜三醇干預(yù)平滑肌細(xì)胞72小時，細(xì)胞內(nèi)RTP-26蛋白的表達(dá)降低15％和47％，與對照組相比也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05和P<0.01)。50μmol/L兒白藜三醇干預(yù)平滑肌細(xì)胞48和72小時，細(xì)胞內(nèi)RTP-26蛋白的表達(dá)降低36％和58％，與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。所以，白藜三醇對血管平滑肌細(xì)胞中RTp-26 mRNA和蛋白的抑制作用也呈濃度依賴和時間依賴的特點(diǎn). 4.RTP-26高表達(dá)載體pEGFP-

12、N1-NQO2成功構(gòu)建并轉(zhuǎn)染大鼠血管平滑肌細(xì)胞，48小時后細(xì)胞內(nèi)RTP-26 mRNA的表達(dá)升高1倍，且表達(dá)由綠色熒光蛋白和RTP-26組成的融合蛋白。但是，用BrdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒測試，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-NQO2質(zhì)粒的平滑肌細(xì)胞與野生型細(xì)胞比較，增殖能力沒有明顯變化。 5.RTP-26 RNA干擾慢病毒載體Psc-NQO2構(gòu)建成功后，轉(zhuǎn)染血管平滑肌細(xì)胞72小時，細(xì)胞內(nèi)RTP-26 mRNA的表達(dá)較野生型細(xì)胞減少74％.

13、延長轉(zhuǎn)染時間至14天，細(xì)胞內(nèi)RTP-26蛋白的表達(dá)幾乎檢測不到。同時，用BrdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒測試，轉(zhuǎn)染Psc-NQO2的平滑肌細(xì)胞與野生型細(xì)胞比較，增殖能力明顯降低(P<0.01)，且與25μmol/L白藜三醇干預(yù)72 結(jié)論： 1.用白藜三醇親合層析柱可以從血管平滑肌中分離、純化一個26kD的蛋白片斷，即白藜三醇結(jié)合蛋白26(RTP-26)，結(jié)合文獻(xiàn)和western blot結(jié)果，證實(shí)RTP-26即NQO2；

14、 2.高膽固醇飼料喂養(yǎng)新西蘭大白兔12周可產(chǎn)生動脈粥樣硬化損傷；球囊內(nèi)皮剝脫術(shù)可制備再狹窄動物模型。白藜三醇能夠抑制動脈粥樣硬化再狹窄的形成，這與其能夠抑制血管壁內(nèi)RTP-26 mRNA和蛋白的表達(dá)有關(guān)。 3.白藜三醇能夠抑制體外培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞的增殖；白藜三醇也能夠抑制培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞胞漿內(nèi)RTP-26mRNA和蛋白的表達(dá)，且具有濃度依賴和時間依賴的特點(diǎn)； 4.RTP-26高表達(dá)對血管平滑肌細(xì)胞的增殖無影響；