鈣釋放激活鈣離子通道在抗血管平滑肌增殖中的作用.pdf

1、目的：鑒定血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)存在鈣釋放激活鈣電流(CRAC)和鈣庫(kù)操控鈣離子內(nèi)流(SOCE)，并進(jìn)一步研究CRAC阻滯劑2-APB在VSMC增殖和表型轉(zhuǎn)換中的作用。
　　 方法：使用免疫細(xì)胞化學(xué)、膜片鉗、鈣離子成像和RNA干擾技術(shù)證實(shí)VSMC上存在由Orail/STIM1介導(dǎo)的CRAC和SOCE。運(yùn)用BrdU共培養(yǎng)和流式細(xì)胞術(shù)量化VSMC增殖、測(cè)定細(xì)胞周期。并比較釓、Rapamycin和2-APB對(duì)VSMC增殖、表型轉(zhuǎn)換

2、的作用。
　　 結(jié)果：⑴運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)，在大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌系A(chǔ)7r5證實(shí)了Orail、STIM1的存在，并記錄到典型的CRAC鈣離子電流。在原代培養(yǎng)的大鼠VSMC上記錄到SOCE，且RNA干擾技術(shù)沉默Orail后可顯著抑制其SOCE。這表明大鼠VSMC中的CRAC/SOCE由Orail/STIM1介導(dǎo)。⑵優(yōu)化了一種簡(jiǎn)單方法，即使用5％胎牛血清(FBS)來(lái)建立VSMC增殖模型。在我們的實(shí)驗(yàn)條件下，基本增殖率約為25％。5μM

3、2-APB使得增殖率升至62.81％，而50μM2-APB使增殖率降至10.28％(p<0.01)。100μM2-APB幾乎完全阻止BrdU的摻入。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步量化，以BrdU摻入率為測(cè)量指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，基本增殖率為27.35±4.49％，100μM2-APB使得增殖率降至3.81±0.28％。這些結(jié)果提示CRAC相對(duì)特異性抑制劑2-APB抑制VSMC增殖。⑶高濃度的2-APB可將VSMC從合成表型逆轉(zhuǎn)為收縮表型。典型地，經(jīng)培養(yǎng)的VS

4、MC體積和細(xì)胞核會(huì)越來(lái)越大，呈上皮樣(菱形)。加入2-APB(100μM)后，這種表型轉(zhuǎn)換被逆轉(zhuǎn)，呈收縮表型，即細(xì)胞變小、呈梭形。細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)，2-APB(100μM)處理后大多數(shù)細(xì)胞停滯在G1/G0期。⑷對(duì)比了Rapamycin和2-APB對(duì)VSMC的作用。10μM Rapamycin抑制VSMC增殖，而50μM時(shí)大部分細(xì)胞被殺死而不是增殖受抑制，提示可能是細(xì)胞凋亡。使用本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ臀窗l(fā)現(xiàn)氯化釓(GdCl3，10μM)對(duì)細(xì)胞增殖或表