NAADP激活雙孔通道對人肺動脈平滑肌細胞內鈣離子濃度的影響.pdf

1、目的：探索人肺動脈平滑肌細胞中是否存在NAADP通過激活TPC1和TPC2誘導鈣釋放這一信號通路，并研究其誘導鈣釋放的基本機制。
　　方法：RT-PCR及蛋白印記測定人肺動脈平滑肌細胞中TPC1及TPC2的表達；使用能透膜的NAADP-AM研究人肺動脈平滑肌細胞上不同濃度NAADP對鈣釋放的影響；Ned-19抑制NAADP對鈣釋放的影響；當細胞外為零鈣時研究NAADP對鈣釋放的影響；研究Bafilomycin A1抑制空泡H-AT

2、P酶以阻斷溶酶體上Ca/H交換來耗竭酸性鈣儲存后NAADP對鈣釋放的影響；Xestospongin C和Ryanodine分別阻斷InsP3受體和RyR受體后NAADP對鈣釋放的影響。
　　結果：
　　1.使用實時定量RT-PCR測定TPC1和TPC2 mRNA，證實人肺動脈平滑肌細胞觀察到TPC1和TPC2 mRNA表達。
　　2.NAADP-AM以濃度依賴性調節(jié)胞漿Ca2+濃度。當NAADP-AM的濃度分別為0.2

3、5μM和0.5μM時胞漿鈣濃度持續(xù)增加，當為1μM時，引起一個雙相性反應，表現為在一個初始相增高峰后接著出現一段平臺期。1μM NAADP-AM引起鈣釋放反應不受零鈣溶液的影響。
　　3.Ned-19(100μM）預處理人肺動脈平滑肌細胞20分鐘阻斷了NAADP-AM誘導鈣反應的初始峰值并且顯著降低持續(xù)相鈣濃度(對照組,285.1±25.2nM(n=6),Ned-19組,134.9±11.2nM(n=6),p<0.01)。

4、　　4.人肺動脈平滑肌細胞外生理濃度鈣時為228.9±19.7(n=5),零鈣時為222.1±18.4nm(n=5),。
　　5.用Bafilomycin A1預處理人肺動脈平滑肌細胞1小時，幾乎完全阻斷NAADP-AM（1μM）調控Ca2+在平均鋒期和平臺期的釋放，對照組的平均峰值為186.4±16.9nM(n=5),BafilomycinA1預處理human PASMCs組平均峰值為81.4±8.8nM(n=5;p<0.05)

5、。
　　6.用Xestospongin C預處理細胞后鈣釋放峰值無變化。
　　7.Ryanodine預處理細胞后鈣釋放的平均峰值部分減少，而持續(xù)相無變化。
　　結論：
　　1.人肺動脈平滑肌細胞上存在TPC1和TPC2，并且以TPC1的表達為主。
　　2.NAADP呈濃度依賴性誘導鈣釋放。
　　3.NAADP誘導鈣釋放主要來自于胞內鈣儲存，且很大可能性這個鈣釋放來自于內溶酶體系統(tǒng)。
　　4.NA