Caveolae對血管平滑肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣濃度調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是由于外傷或顱內(nèi)動脈瘤破裂導(dǎo)致的血液成分進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔后所引起的一組臨床癥狀,而腦血管痙攣(cerebral vasospasm,CVS)則是SAH后最嚴(yán)重的并發(fā)癥,常引起嚴(yán)重腦組織缺血或遲發(fā)缺血性腦損害,甚至導(dǎo)致腦梗塞,為患者致殘和致死的主要因素。而引起CVS發(fā)生的直接原因是SAH后血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth mus

2、cle cells,VSMCs)上鈣通道表達(dá)及活性發(fā)生變化,引起胞內(nèi)鈣濃度升高,通過激活肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK)途徑引起平滑肌收縮。
　　小窩(caveolae)是細(xì)胞質(zhì)膜表面特異性的內(nèi)陷微區(qū),大小約50-100nm形如燒瓶狀。它是細(xì)胞質(zhì)膜中相對穩(wěn)定且流動性不大的區(qū)域,被稱為細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換和信號傳導(dǎo)的平臺。小窩蛋白-1(caveolin-1)是 caveolae的表面標(biāo)記功

3、能蛋白,具有腳手架樣結(jié)構(gòu)(caveolin scaffolding domain,CSD),聚集了血小板源性生長因子受體、胰島素受體和血管緊張素受體等多種膜受體,是小窩的發(fā)揮生理作用的功能蛋白。至今 Caveolin-1/caveolae在調(diào)節(jié)VSMCs鈣通道表達(dá)及活性,進(jìn)而影響CVS發(fā)生和發(fā)展的報(bào)道較少。為此本研究通過改變體外培養(yǎng)VSMCs的caveolin-1蛋白表達(dá),研究caveolin-1表達(dá)的改變對VSMCs胞內(nèi)鈣濃度([Ca

4、2+]i)的變化帶來的影響,以探討caveolin-1/ caveolae在腦血管痙攣中的可能作用。
　　方法:
　　1、分離SD大鼠頸總動脈,利用組織貼塊法體外培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞,通過對細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和平滑肌細(xì)胞特異性α-肌動蛋白(α-actin)免疫熒光染色進(jìn)行鑒定。
　　2、蛋白印跡Western blot法檢測1mmol/L、2.5 mmol/L和5 mmol/L濃度MβCD溶液處理后VSMCs caveoli

5、n-1表達(dá)水平。
　　3、蛋白印跡Western blot法檢測20 ug/L、50 ug/L、100ug/L濃度TNF-α溶液孵育后VSMCs caveolin-1表達(dá)水平。
　　4、通過 MβCD(5mmol/L)和炎癥因子 TNF-α(100ug/L)的不同處理將細(xì)胞分為四組:A.對照組;B. MβCD組;C. TNF-α組;D. TNF-α+MβCD組。采用TILL熒光鈣成像系統(tǒng)檢測活細(xì)胞在ET-1(100nmol/

6、L)刺激下胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度(FI)變化情況。
　　結(jié)果:
　　1、經(jīng)過對細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和α-actin免疫熒光染色鑒定,原代成功分離和培養(yǎng)大鼠頸總動脈VSMCs。
　　2、在不同濃度MβCD作用下使細(xì)胞caveolin-1蛋白含量隨MβCD濃度的升高而降低。caveolin-1蛋白含量5mmol/L MβCD處理組較對照組下降明顯(P<0.01)。
　　3、在不同濃度TNF-α作用下使細(xì)胞caveolin-1蛋白含

7、量隨TNF-α濃度的升高而升高。caveolin-1蛋白含量100ug/L濃度TNF-α處理組較對照組上升明顯(P<0.01)。
　　4、TILL熒光鈣成像系統(tǒng)檢測四組細(xì)胞結(jié)果顯示1)、各組細(xì)胞靜息狀態(tài)R0分別為A:0.5916±0.0820,B:0.5753±0.0790, C:0.6551±0.0837,D:0.6105±0.0804,四間細(xì)胞組間無顯著差異(P>0.05)。2)、四組細(xì)胞經(jīng)相同刺激后胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度(FI)分別

8、較靜息狀態(tài)上升,A組上升(115±17)％;B組上升(67±15)%,較A組差異顯著(P<0.05);C組上升(279±21)%,較A組差異顯著(P<0.01);D組上升(88±16)%,較C組差異顯著(P<0.01)。
　　結(jié)論:
　　1、5mmol/L MβCD能有效干擾破壞細(xì)胞膜 caveolae結(jié)構(gòu),可顯著下調(diào) VSMCs caveolin-1蛋白表達(dá)。
　　2、100ug/L TNF-α孵育可顯著上調(diào)VSMC