全反式維甲酸對血管平滑肌細胞黏附的調節(jié)作用.pdf

1、目的：血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)的黏附、增殖與遷移是高血壓、動脈粥樣硬化和血管成形術后再狹窄等血管重塑性疾病的細胞病理學基礎。其中VSMC的黏附是介導其增殖和遷移的關鍵環(huán)節(jié)，對維持細胞的生存和正常血管壁結構至關重要。全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)是維生素A的衍生物，能夠誘導多種腫瘤細胞分化和凋亡。本實驗通過觀察ATRA對體外培養(yǎng)的VSMC黏

2、附以及相關黏附分子表達的影響，試圖揭示ATRA抑制增殖誘導凋亡的作用機制。 方法： 1.VSMC的培養(yǎng)及ATRA處理 1.1 VSMC的培養(yǎng)：取5周齡SD大鼠胸腹主動脈，按貼塊法分離培養(yǎng)VSMC。每隔3 d換液一次，至細胞呈單層匯合后，以0.25％胰蛋白酶消化傳代，取3～6代細胞進行實驗。傳代培養(yǎng)的VSMC生長到70～80％匯合時，給予全反式維甲酸刺激。 1.2 ATRA處理：用10μM的ATRA分別處理

3、VSMC 0，24，48 h，確定ATRA的時效關系。分別用0，5，10μM.ATRA處理VSMC 48 h，確定ATRA的量效關系。 2.VSMC黏附試驗取3～6代的VSMC，血清饑餓使細胞同步化于靜止期。按照分組給予不同時間劑量ATRA刺激。然后，將VSMC用胰蛋白酶消化，接種于96孔板在規(guī)定的時間內取出孔板，用4％多聚甲醛室溫固定，光鏡下觀察黏附的細胞并計數(shù)。隨后用甲苯胺藍染色，裂解細胞后，于λ595 nm測吸光度值，計算

4、細胞黏附活性。 3 VSMC黏附分子的表達細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)和血管細胞間黏附分子-1(vascular cellularadhesion molecule-1，VCAM-1)是VSMC正常表達的黏附分子，在VSMC黏附中起重要作用。按照分組給予體外培養(yǎng)的VSMC不同劑量、時間的ATRA刺激，使用免疫細胞化學染色法和Western Bolt觀察兩種蛋白的表

5、達變化；用Trizol一步法提取各組VSMC的總RNA，反轉錄后，經半定量RT-PCR觀察基因的轉錄活性。 結果： 1.不同時間、劑量ATRA對VSMC黏附的影響將ATRA預處理的VSMC接種于96孔板，置于37℃一定時間后，觀察細胞貼壁情況。細胞計數(shù)結果表明，ATRA能夠降低VSMC的黏附能力，給予終濃度10μM ATRA后，與對照組相比，24 h組和48 h組VSMC黏附數(shù)量隨ATRA預處理的延長均較對照組有所下降，

6、分別為對照組的85.8％(P>0.05)和35.3％(P<0.05)；用不同濃度(5，10μM)ATRA處理VSMC 48 h后，5μM組和10μM組VSMC黏附數(shù)量隨劑量增加均較對照組有所下降，分別為對照組的59.1％和34.7％(P<0.05)。同樣條件下，甲苯胺藍染色試驗結果經統(tǒng)計分析與細胞計數(shù)結果一致。 2.不同時間、劑量ATRA對VSMC黏附分子表達水平的影響免疫細胞化學染色結果顯示，在未經ATRA處理的VSMC中，I

7、CAM-1和VCAM-1染色為棕褐色顆粒，著色較深，均勻分布于細胞表面。ATRA預處理的VSMC中ICAM-1、VCAM-1蛋白陽性著色顆粒減少。給予終濃度10μM ATRA刺激后，與0 h組相比，24 h組和48 h組VSMC細胞膜表面ICAM-1、VCAM-1染色明顯變淺；給予不同劑量ATRA刺激48 h后，5μM組和10μM組VSMC的ICAM-1、VCAM-1表達量較未處理組明顯減少。 半定量RT-PCR結果顯示，ATR

8、A可以下調VSMC中ICAM-1、VCAM-1基因的轉錄活性。給予終濃度10μMATRA刺激后，與0 h組相比，24 h組和48 h組的ICAM-1mRNA水平分別降低了16％和47％；VCAM-1 mRNA水平分別下降了32％和48％。 用不同濃度ATRA處理VSMC后，ICAM-1和VCAM-1mRNA表達呈劑量依賴性減少，5μM ATRA即可使ICAM-1和VCAM-1 mRNA水平分別降低50％和 29％；10 μM A

9、TRA可使ICAM-1和VCAM-1 mRNA水平分別下降54％和51％。 Western Bolt結果顯示，ATRA能夠抑制ICAM-1、VCAM-1蛋白表達。給予終濃度10μM ATRA處理VSMC后，與對照組相比，24 h組和48 h組的ICAM-1蛋白表達隨刺激時間延長而下降，分別為對照組的85.8％(P>0.05)和57.6％(P<0.05)；兩組的VCAM-1蛋白表達亦隨刺激時間延長而下降，分別為0 h組的80.1％

10、(P>0.05)和63.6％(P<0.05)。 與RT-PCR結果相似，5μM組和10μM組ICAM-1蛋白表達隨劑量增加逐步下降，分別為0μM組的52.9％和46.4％(P<0.05)；VCAM-1蛋白表達亦隨時間延長而下降，分別為對照組的50.6％和44.6％(P<0.05)。 結論： 1.ATRA可抑制VSMC的黏附活性，其抑制效應呈劑量依賴性和時間依賴性。 2.ATRA可以在轉錄和翻譯水平上，以劑