全反式維甲酸和TGF-β1協(xié)同調節(jié)KLF4表達及促進血管平滑肌細胞分化的分子機制.pdf

1、目的：血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)發(fā)生表型轉化是血管重塑性疾病，如高血壓、動脈粥樣硬化等心血管疾病的重要細胞病理學基礎。Krüppel樣因子4(krüppel-like factor4，GKLF/KLF4)是KLF家族中與胚胎發(fā)育、細胞增殖、分化、細胞重編程和癌癥發(fā)生密切相關的一種含有鋅指結構的轉錄因子。在VSMC中，KLF4具有抗增殖和促分化的作用。維生素A衍生物全反式維甲酸(al

2、l-trans retinoic acid，ATRA)通過與受體RAR(retinoic acid receptor)和 RXR(retinoid X receptor)相互作用，對多種細胞的增殖、分化、遷移和凋亡發(fā)揮調節(jié)作用。轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)通過與細胞膜受體TβR-Ⅰ(TGF-β typeⅠ receptor)或TBR-Ⅱ(TGF-β typeⅡ receptor)

3、結合觸發(fā)調節(jié)細胞生長、分化、凋亡的信號途徑。在VSMC中，ATRA和TGF-β1均可誘導KLF4基因的表達及促進VSMC分化，但ATRA和TGF-β1對KLF4基因表達和VSMC分化是否具有協(xié)同效應目前尚不清楚。本研究觀察ATRA和TGF-β1對VSMC中KLF4表達的影響，探討ATRA和TGF-β1協(xié)同調節(jié)KLF4表達及VSMC分化的分子機制。
　　方法：用貼塊法分離、培養(yǎng)大鼠主動脈VSMC；Western blot分析檢測KL

4、F4、SM22α、PCNA、cyclin D1和p21的表達；細胞計數(shù)法和BrdU摻入法檢測細胞增殖情況；HE染色和鬼比環(huán)肽染色觀察細胞形態(tài)和應力纖維的變化；傷口愈合實驗和VSMC跨膜遷移實驗觀察細胞的平面遷移和跨膜遷移能力。
　　結果：
　　1 ATRA和TGF-β1協(xié)同調節(jié)KLF4基因表達
　　以10μmol/L ATRA或1μmol/L9cRA刺激VSMC2 h后，加入2 ng/mLTGF-μ1孵育24 h，收集

5、細胞，提取細胞總蛋白進行Western blot分析。結果顯示，單獨給予ATRA或TGF-β1刺激后，KLF4表達水平均比對照組顯著升高，聯(lián)合應用ATRA和TGF-β1刺激VSMC，可進一步上調KLF4表達水平，二者具有協(xié)同效應。單獨給予9cRA或9cRA與TGF-β1聯(lián)合應用對KLF4表達無明顯影響。以上結果表明，ATRA和TGF-β1協(xié)同激活KLF4基因表達。
　　2抑制維甲酸受體RARα激活可阻斷TGF-β1對KLF4表達的

6、誘導作用
　　維甲酸受體RAR有三種亞型，即：RARα、RARβ和RARγ，其中，RARα在VSMC分化過程中發(fā)揮重要作用。以上研究證實，ATRA和TGF-β1協(xié)同激活KLF4基因表達。為了檢查ATRA和TGF-β信號之間是否存在聯(lián)系，我們用RARα特異性抑制劑Ro41-5253(20μmol/L)抑制RARα活性后，再用TGF-β1(2 ng/mL)刺激VSMC24 h，收集細胞，提取細胞總蛋白進行Western blot分析。

7、結果表明，在Ro41-5253預處理的細胞中，TGF-β1上調KLF4表達的作用被阻斷，提示TGF-β1上調KLF4表達有賴于維甲酸信號的活化。
　　3 ATRA和TGF-β1協(xié)同抑制VSMC增殖
　　為了進一步確定ATRA和TGF-β1協(xié)同激活KLF4表達的生物學效應，我們觀察ATRA和TGF-β1對VSMC增殖相關基因PCNA及細胞周期正調節(jié)蛋白cyclin D1和負調節(jié)蛋白p21表達的影響。結果表明，ATRA和TGF-

8、β1協(xié)同抑制PCNA和cyclin D1表達，促進p21表達。用RARα特異性抑制劑Ro41-5253抑制RARα活性后，在一定程度上阻斷TTGF-β1對PCNA表達的下調作用。細胞計數(shù)和BrdU摻入結果顯示，用ATRA和TGF-β1處理細胞后，細胞計數(shù)及BrdU摻入率均較對照組明顯減少，表明二者協(xié)同抑制VSMC增殖。
　　4 ATRA和TGF-β1協(xié)同誘導VSMC分化
　　為了探討ATRA和TGF-β1對VSMC分化和細胞

9、生物學行為的影響，我們用ATRA和TGF-β1單獨或聯(lián)合刺激VSMC后，分別檢查VSMC分化標志基因SM22α表達、細胞骨架形態(tài)變化和細胞遷移活性。結果表明，單獨給予ATRA或TGF-β1刺激均能上調SM22α表達，二者聯(lián)合刺激VSMC后，SM22α的表達比單一因素刺激進一步增加。用RARα特異性抑制劑Ro41-5253抑制RARα活性后，TGF-β1對SM22α表達的上調作用受到抑制。HE染色和鬼筆環(huán)肽染色均顯示，聯(lián)合應用ATRA和T

10、GF-β1刺激VSMC后，細胞形態(tài)由多角形轉變?yōu)殚L梭形，細胞骨架規(guī)則，肌絲粗大；細胞傷口愈合實驗和Boyden小室跨膜遷移實驗結果表明，ATRA和TGF-β1聯(lián)合刺激可顯著抑制VSMC遷移。以上結果表明，ATRA和TGF-β1通過協(xié)同誘導VSMC分化而抑制VSMC遷移。
　　結論：
　　1 ATRA和TGF-β1協(xié)同調節(jié)KLF4基因表達。
　　2抑制維甲酸受體RARα激活可阻斷TGF-β1對KLF4表達的誘導作用。