KLF4在血管平滑肌細胞胞質中的定位和功能.pdf

1、目的：血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)表型轉化是高血壓、動脈粥樣硬化、血管再狹窄等血管重塑性疾病的主要細胞病理學基礎。KLF4(Krüppel-like factor4)是Krüppel樣轉錄因子家族的成員之一，該家族是具有鋅指結構的一類轉錄因子家族，廣泛的參與胚胎發(fā)育、細胞分化和癌癥發(fā)生等過程。KLF4主要定位于胞核，通過激活分化標志基因(如SMα-actin、SM22α)的表達，發(fā)

2、揮抑制細胞增殖、誘導分化的作用。目前對KLF4功能主要局限在細胞核，關于KLF4在胞漿的分布及其功能尚少有報道。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，PDGF-BB可以促進KLF4表達和核輸出，但KLF4在胞漿中的定位和功能尚不清楚。本研究以PDGF-BB為誘導因素，探討了KLF4調節(jié)細胞骨架重構的分子機制。
　　方法：細胞免疫熒光染色分析檢測KLF4與細胞骨架的相互作用；Western blot分析檢測KLF4出入核的途徑；GST pull-dow

3、n分析檢測KLF4與actin相互作用的結構基礎；報告基因分析檢測KLF4對SM22α啟動子活性的影響。
　　結果：
　　1 CRM1介導KLF4出核
　　用CRM1阻斷劑LMB(20 ng/mL)預處理VSMC8 h后，再給予PDGF-BB(20 ng/mL)刺激VSMC2 h，分別提取胞漿蛋白和胞核蛋白進行Western blot分析。結果顯示，與對照組相比，LMB可以顯著抑制PDGF-BB對KLF4出核的誘導作用

4、。細胞免疫熒光染色結果也顯示，與對照組相比，PDGF-BB處理增加KLF4在胞漿中的分布，給予LMB預處理后，胞漿中幾乎看不到KLF4分布。提示，PDGF-BB通過CRM1途徑誘導KLF4核輸出。
　　2 KLF4參與細胞骨架重構，具有穩(wěn)定細胞骨架的作用
　　用pEGFP-N1和pEGFP-N1-KLF4質粒轉染VSMC后，再用PDGF-BB、細胞骨架聚合劑(JPK)、細胞松弛素(CB)處理細胞，觀察KLF4亞細胞定位的變化

5、。細胞免疫熒光染色結果顯示，對照組細胞含有大量平行束狀纖維，PDGF-BB刺激后，束狀分布的應力纖維減少，肌絲排列成為網狀。CB刺激后，應力纖維消失，微絲解聚，呈彌散狀分布于胞質中，細胞無法維持正常的形態(tài)。相反，JPK則使細胞應力纖維變的粗大。KLF4過表達可以促進肌絲成束，應力纖維增粗。轉染KLF4后再給予PDGF-BB刺激，肌絲仍保持束狀排列，沒有明顯的網格化改變；還發(fā)現(xiàn)過表達KLF4也可以抵抗CB誘導的應力纖維解聚，提示，KLF4

6、在胞漿中有穩(wěn)定細胞骨架的作用。
　　3 KLF4通過與actin相互作用參與細胞骨架重構
　　為了明確KLF4參與細胞骨架重構及穩(wěn)定細胞骨架的作用是否與其和SMα-actin相互作用有關，我們分別用PDGF-BB、CB、JPK處理VSMC2 h后，觀察KLF4與actin的相互作用。免疫雙熒光細胞共定位分析結果顯示，PDGF-BB使KLF4在胞漿中的分布增加，并與actin在胞漿外邊緣相互重合為黃色熒光；CB使肌絲解聚為彌散

7、狀，且胞漿中TRITC標記的KLF4與FITC標記的actin無明顯的熒光重疊；JPK使肌絲聚合呈束狀，應力纖維粗大，KLF4與actin共定位更加明顯。上述結果表明，KLF4通過與actin相互作用調節(jié)細胞骨架的解聚和聚合。
　　4 KLF4分子中第117-181位氨基酸是actin與KLF4結合所必須的
　　為了進一步明確KLF4與actin相互作用的結構基礎，我們用KLF4不同截短體表達質粒轉化宿主菌，經IPTG誘導后

8、通過GST親和層析純化，得到分子量不同的的GST-KLF4-2、GST-KLF4-3、GST-KLF4-4、GST-KLF4-全長融合蛋白。將結合有5種融合蛋白的GST-Sepharose4B與VSMC融合蛋白裂解液共孵育8 h，沉淀經充分沈滌后，進行SDS-PAGE分離及Western blot分析。結果顯示，GST-KLF4-3與actin之間有較強的相互作用，其他融合蛋白上結合的actin較少。以上結果證實，KLF4分子中第117

9、-181位氨基酸是actin與KLF4相互作用的結構域。
　　5 KLF4磷酸化和蘇素化修飾影響細胞骨架的重構
　　為了確定KLF4修飾與細胞骨架重構的關系，我們分別用KLF4磷酸化位點Ser-251和Ser-255突變體表達載體和蘇素化位點k-225+229突變體表達載體轉染VSMC后，給予PDGF-BB刺激，細胞免疫熒光染色法觀察不同突變體對細胞骨架重構的影響。結果顯示，沒有給予PDGF-BB處理時，各轉染組細胞骨架均為

10、束狀，無明顯區(qū)別；但是給予PDGF-BB后，轉染磷酸化位點突變體的細胞，細胞骨架發(fā)生明顯改變，表現(xiàn)為應力纖維增粗，向細胞邊緣聚集，細胞形態(tài)由長梭形變?yōu)槎嘟切?。轉染蘇素化位點突變體后，應力纖維也增粗，但排列明顯無序紊亂。提示PDGF-BB誘導的KLF4磷酸化和蘇素化均參與了細胞骨架重構的調節(jié)。
　　結論：
　　1 CRM1介導KLF4出核；
　　2 KLF4參與細胞骨架重構，具有穩(wěn)定細胞骨架的作用；
　　3 KLF