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文檔簡介
1、目的:維生素A的衍生物全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)在多種細(xì)胞中具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和誘導(dǎo)分化的作用。維甲酸受體(retinoicacid receptor,RAR)是一類重要的核受體,有RARα、RARβ和RARγ三種亞型。該類受體通過與其相應(yīng)的配體ATRA相結(jié)合,激活或抑制多種基因的表達(dá),從而在細(xì)胞增殖、分化及凋亡過程中發(fā)揮重要的作用。Krüppel樣因子4(krüppel-like facto
2、r,GKLF/KLF4)是一類含有鋅指結(jié)構(gòu)的核轉(zhuǎn)錄因子,對血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)具有抑制增殖、誘導(dǎo)分化的作用。
大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在VSMC中,ATRA可以顯著誘導(dǎo)KLF4基因的表達(dá),但目前ATRA誘導(dǎo)KLF4表達(dá)的分子機(jī)制尚不清楚。本研究探討ATRA激活KLF4基因表達(dá)的機(jī)制,研究RARα及相關(guān)的信號通路在ATRA誘導(dǎo)KLF4表達(dá)過程中的作用,以期明確ATRA
3、誘導(dǎo)VSMC分化的分子基礎(chǔ)。
方法:用貼塊法分離、培養(yǎng)大鼠VSMC,胰蛋白酶消化傳代,取3~5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Western blot分析檢測ATRA對KLF4和RARα表達(dá)的影響,應(yīng)用不同信號通路抑制劑研究介導(dǎo)KLF4表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
結(jié)果:
1 ATRA誘導(dǎo)KLF4和RARα表達(dá)
以10μMATRA刺激VSMC0、6、12、24 h后,提取細(xì)胞總蛋白和RNA,分別進(jìn)行Wes
4、tern blot分析和RT-PCR。結(jié)果顯示,隨著ATRA刺激時(shí)間的延長,KLF4的表達(dá)水平呈時(shí)間依賴性升高,同時(shí)RARα表達(dá)水平亦顯著增高,提示RARα可能參與ATRA誘導(dǎo)KLF4的表達(dá)。
2 RARα介導(dǎo)ATRA誘導(dǎo)的KLF4表達(dá)
應(yīng)用RARtα拮抗劑Rα41-5253(20μM)預(yù)處理VSMC1 h后,ATRA(10μM)刺激VSMC24 h,分別提取細(xì)胞總蛋白和RNA,進(jìn)行Westernblot分析
5、和RT-PCR。結(jié)果顯示,應(yīng)用RARα抑制劑預(yù)處理細(xì)胞后,ATRA上調(diào)KLF4表達(dá)的作用受到抑制。為了進(jìn)一步驗(yàn)證RARα是否介導(dǎo)ATRA誘導(dǎo)的KLF4表達(dá),將RARα的特異性小干擾RNA(RARα-siRNA)導(dǎo)入VSMC,阻斷內(nèi)源性RARα表達(dá)后,檢測KLF4的表達(dá)變化。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染RARα-siRNA的細(xì)胞與轉(zhuǎn)染NS-siRNA的對照組相比,ATRA對KLF4表達(dá)的誘導(dǎo)作用被抑制,表明RARα介導(dǎo)ATRA對KLF4表達(dá)的誘導(dǎo)作用。
6、
3 ATRA激活p38 MAPK、抑制ERK信號通路
為了探討ATRA通過哪些信號途徑激活KLF4基因表達(dá),應(yīng)用ATRA(10μM),刺激VSMC0、15、30、60 min后,分別檢測ERK、p38 MAPK、Akt及β-catenin的磷酸化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ATRA刺激15 min后,ERK的磷酸化水平降低,p38 MAPK的磷酸化水平顯著升高,ATRA刺激不影響Akt和β-catenin的磷酸化水平。
7、表明ATRA能夠抑制ERK信號通路,激活p38MAPK通路。
4 RARα通過ERK和p38 MAPK信號調(diào)節(jié)KLF4基因表達(dá)
為了進(jìn)一步探討RARα在ATRA誘導(dǎo)KLF4基因表達(dá)中的作用,應(yīng)用RARα拮抗劑Ro41-5253預(yù)處理VSMC1 h后,ATRA刺激VSMC1 h。Western blot分析發(fā)現(xiàn),ERK磷酸化水平與對照組相比明顯升高,p38磷酸化水平顯著降低。此外,應(yīng)用RARα-siRNA轉(zhuǎn)染V
8、SMC,敲低內(nèi)源性RARα表達(dá)后,ERK磷酸化水平與對照組相比升高,p38 MAPK磷酸化水平顯著降低,表明RARα通過ERK和p38 MARK信號調(diào)節(jié)KLF4基因表達(dá)。
5 p38 MAPK信號介導(dǎo)ATRA誘導(dǎo)的KLF4表達(dá)
為了進(jìn)一步證明ATRA誘導(dǎo)KLF4表達(dá)與p38 MAPK和ERK信號通路的相關(guān)性,分別用p38 MAPK特異性抑制劑SB203580(20μM),ERK抑制劑PD98059(20μM)
9、及Akt抑制劑LY294002(20μM)預(yù)孵育VSMC2 h后,給予ATRA刺激24 h,收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果顯示,抑制p38 MAPK信號途徑可使ATRA誘導(dǎo)KLF4表達(dá)的作用受到抑制,抑制ERK信號途徑上調(diào)KLF4表達(dá),抑制Akt信號途徑不影響ATRA對KLF4表達(dá)的誘導(dǎo)作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證ERK信號途徑在ATRA誘導(dǎo)KLF4表達(dá)中的作用,應(yīng)用ERK的持續(xù)活化型質(zhì)粒pCMV-MEKca轉(zhuǎn)染VSMC,ATR
10、A刺激細(xì)胞24 h后,收集細(xì)胞檢測KLF4的表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染pCMV-MEKca的細(xì)胞與轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒(pCMV)的細(xì)胞相比,ATRA誘導(dǎo)KLF4表達(dá)的作用受到抑制。以上結(jié)果表明,p38 MAPK和ERK信號通路在ATRA調(diào)節(jié)KLF4基因表達(dá)中發(fā)揮重要的作用。
結(jié)論:
1在VSMC中,ATRA誘導(dǎo)KLF4和RARα表達(dá)。
2 RARα介導(dǎo)ATRA對KLF4基因表達(dá)的誘導(dǎo)
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