KLF4在全反式維甲酸誘導(dǎo)線粒體融合蛋白2表達中的作用及機制研究.pdf

1、已經(jīng)證明，血管活性物質(zhì)及其受體、細胞因子及其受體和細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子所構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞（vascularsmoothmusclecell，VSMC）的功能。近年發(fā)現(xiàn)，全反式維甲酸（all-transretinoicacid，ATRA）及其受體以直接或間接的方式參與VSMC生物學行為的調(diào)節(jié)。
　　 Krüppel-likefactor4（KLF4）是一類具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與多種細胞的生長、增殖、分化及凋亡

2、的調(diào)節(jié)。
　　 Mfn-2（亦稱為增殖抑制基因，HSG）是一種線粒體融合蛋白，主要在高能量需求的組織，如骨骼肌和心肌中表達。本研究利用現(xiàn)代分子生物學和細胞生物學實驗技術(shù)，研究KLF4在ATRA誘導(dǎo)mfn-2表達中的作用及作用機制，發(fā)現(xiàn)在VSMC中，KLF4通過直接與mfn.2啟動子結(jié)合激活mfn.2表達，ATRA通過激活JNK和p38MAPK信號通路使KLF4磷酸化，磷酸化型KLF4與p300結(jié)合并被其乙酰化。KLF4乙?；笈c

3、mfn-2啟動子的結(jié)合活性增強。另外，在ATRA處理的VSMC中，RARα與KLF4共同激活mfn-2啟動子。
　　 1.KLF4介導(dǎo)ATRA誘導(dǎo)的mfn-2表達ATRA可同時上調(diào)KLF4和mfn-2表達，但KLF4在ATRA誘導(dǎo)mfn-2表達中的作用尚不清楚。本部分旨在探討KLF4是否介導(dǎo)ATRA誘導(dǎo)的mfn-2表達。實驗結(jié)果如下：
　　 1.1KLF4介導(dǎo)ATRA對mfn-2表達的誘導(dǎo)作用RT-PCR和Western

4、blot結(jié)果顯示，ATRA可顯著誘導(dǎo)KLF4和mfn-2表達，并具有明顯的時效關(guān)系。其中，ATRA濃度為10μM和作用時間為24h時兩者的表達變化最明顯。
　　 1.2KLF4直接結(jié)合到mfn-2啟動子上并調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄為了明確KLF4是否直接激活mfn-2啟動子，用mfn-2報告基因（pGL3-mfn-2-luc）和KLF4表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染A293細胞，熒光素酶活性分析結(jié)果顯示，過表達KLF4以劑量依賴的方式增加mfn-2啟動子活性

5、。
　　 1.3KLF4介導(dǎo)ATRA誘導(dǎo)的線粒體成簇和線粒體去極化為了分析mfn-2表達上調(diào)對VSMC線粒體動力學的影響，分別用熒光染色和電鏡觀察ATRA處理和KLF4過表達所引起的線粒體形態(tài)變化。
　　 以上結(jié)果表明，mfn-2是受KLF4調(diào)控的靶基因，在VSMC中，KLF4介導(dǎo)ATRA誘導(dǎo)的mfn-2表達，提示KLF4在ATRA信號通路中發(fā)揮重要作用。
　　 2.KLF4對mfn-2的轉(zhuǎn)錄激活與ATRA誘導(dǎo)K

6、LF4與p300相互作用及KLF4乙?；嚓P(guān)聯(lián)KLF4的轉(zhuǎn)錄活性受與之相互作用的輔助因子以及翻譯后修飾如磷酸化、乙?；榷喾N方式的影響。本部分實驗探討ATRA對KLF4磷酸化和乙?；揎椀挠绊?，并研究這些修飾在KLF4調(diào)節(jié)mfn-2表達中的意義。
　　 2.1ATRA誘導(dǎo)KLF4乙?；癁榱岁U明ATRA促進KLF4激活mfn-2轉(zhuǎn)錄的分子機制，本部分實驗首先檢測ATRA對KLF4乙?；挠绊憽嶒灲Y(jié)果表明，隨著VSMC被ATRA刺

7、激時間的延長，KLF4乙?；街饾u升高。
　　 2.2ATRA通過激活JNK和p38信號通路誘導(dǎo)KLF4磷酸化以及KLF4與p300的相互作用為了明確KLF4與p300相互作用是否依賴于KLF4磷酸化，我們檢測ATRA對KLF4磷酸化的影響。實驗結(jié)果表明，ATRA刺激VSMC0.5h，KLF4的磷酸化水平開始升高，到1h達到高峰，并維持在此水平至2h。在相同的實驗條件下，JNK和p38MAPK的磷酸化水平也顯著升高，但ATRA

8、刺激不影響Akt和ERK的磷酸化水平。分別以ERK特異性抑制劑PD98059、Akt特異性抑制劑LY294002、p38MAPK特異性抑制劑SB203580和JNK特異性抑制劑SP600125處理VSMC，阻斷ERK、Akt、p38MAPK或JNK信號通路的活化后，再以10μMATRA刺激細胞1h。
　　 Westernblot結(jié)果顯示，SP600125和SB203580預(yù)處理可顯著抑制ATRA誘導(dǎo)的KLF4磷酸化，而PD980

9、59和LY294002對KLF4磷酸化無明顯影響。VSMC被KLF4磷酸化位點突變體轉(zhuǎn)染后，再以10μMATRA刺激細胞1h，與對照組（轉(zhuǎn)染野生型KLF4表達載體）相比，KLF4磷酸化水平明顯下降，同時，KLF4與p300的結(jié)合明顯減少。
　　 為了闡明KLF4乙?；欠褚蕾囉谒牧姿峄捌渑cp300的相互作用，用SB203580和SP600125處理VSMC或者用KLF4磷酸化位點突變體轉(zhuǎn)染VSMC后檢測KLF4的磷酸化水平。

10、結(jié)果顯示，這些抑制劑或KLF4磷酸化位點突變體在抑制KLF4磷酸化的同時，也使KLF4乙?；斤@著降低。
　　 報告基因分析結(jié)果顯示，將KLF4磷酸化位點突變體和p300共轉(zhuǎn)染A293后，KLF4激活mfn-2啟動子的作用消失。另外，用SP600125和SB203580處理A293細胞或者用KLF4磷酸化位點突變體轉(zhuǎn)染A293細胞，在KLF4磷酸化受到抑制后，ATRA喪失對mfn-2啟動子的激活作用。
　　 以上結(jié)果表

11、明，ATRA通過誘導(dǎo)KLF4磷酸化促進其與p300相互作用，以及KLF4乙?；阴；蚄LF4對mfn-2的轉(zhuǎn)錄激活作用增強。
　　 3.RARα通過與KLF4相互作用促進KLF4對mfn-2啟動子的激活A(yù)TRA既可通過其受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，也可通過調(diào)節(jié)受體與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的相互作用而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活作用。第二部分實驗已經(jīng)證實，KLF4通過JNK和p38MAPK信號途徑介導(dǎo)ATRA對mfn-2表達的誘

12、導(dǎo)作用，本部分實驗進一步探討維甲酸受體（RAR）在KLF4激活mfn-2表達中的作用。
　　 3.1ATRA誘導(dǎo)RARα和RARβ的表達ATRA能否誘導(dǎo)VSMC表達RAR目前尚不清楚。為了闡明RAR在KLF4介導(dǎo)mfn-2基因表達中的作用，首先檢查ATRA對RAR表達的影響。Westernblot和RT-PCR結(jié)果顯示，ATRA以時間和劑量依賴的方式顯著誘導(dǎo)RARα表達，輕微上調(diào)RARβ表達，對RARγ的表達沒有影響。
　

13、　 3.2RARα通過與KLF4結(jié)合參與ATRA誘導(dǎo)KLF4乙酰化的過程因為在mfn-2啟動子區(qū)不存在RAR結(jié)合元件，因此，我們推測，RAR可能通過與KLF4相互作用或通過影響KLF4修飾間接調(diào)節(jié)mfn-2的表達。我們首先用RARα拮抗劑（Ro41-5253）和RARβ拮抗劑（LE135）處理VSMC或?qū)邢騌AR的小干擾RNA（siRNA）導(dǎo)入VSMC，抑制內(nèi)源性RAR表達后，進一步研究RAR對KLF4修飾的影響。Westernbl

14、ot結(jié)果顯示，RARα和RARβ拮抗劑不影響ATRA誘導(dǎo)的KLF4磷酸化。用RARα-siRNA敲低RARα表達顯著抑制KLF4乙?；玫蚏ARβ和RARγ對KLF4乙?；瘺]有影響。為了闡明RAR促進KLF4乙酰化的機制，我們檢測KLF4與RAR的相互作用。免疫共沉淀分析結(jié)果證實，ATRA僅促進KLF4與RARα的結(jié)合。
　　 3.3RARα促進KLF4對mfn-2啟動子的激活報告基因分析結(jié)果表明，與單獨過表達KLF4相比，共

15、表達RARα和KLF4顯著增強KLF4對mfn-2啟動子的激活作用，共轉(zhuǎn)染RARα和KLF4表達載體后，再以ATRA刺激細胞可使mfn-2啟動子活性進一步升高。然而，在單獨過表達RARα條件下，無論ATRA刺激與否，均不能增強mfn-2啟動子活性。
　　 3.4RARα與KLF4相互作用依賴于KLF4磷酸化上述實驗證實，KLF4與p300相互作用依賴于KLF4磷酸化。本部分實驗進一步檢查KLF4磷酸化是否影響其與RARα結(jié)合。免

16、疫共沉淀分析結(jié)果證實，用SP600125和SB203580處理VSMC或者用KLF4磷酸化位點突變體轉(zhuǎn)染VSMC后，ATRA誘導(dǎo)的RARα與KLF4的相互作用顯著降低。結(jié)果表明，RARα與KLF4相互作用依賴于KLF4的磷酸化。
　　 3.5敲低RARα表達抑制KLF4與p300結(jié)合為了進一步明確RARα促進KLF4乙酰化的分子機制，將靶向RARα的小干擾RNA導(dǎo)入VSMC，阻斷ATRA誘導(dǎo)的內(nèi)源性RARα表達后，檢查RARα對

17、KLF4與p300相互作用的影響。免疫共沉淀分析結(jié)果顯示，敲低RARα表達顯著抑制KLF4與p300的結(jié)合。
　　 以上結(jié)果顯示ATRA通過誘導(dǎo)KLF4磷酸化而促進KLF4與RARα的結(jié)合，二者的結(jié)合有利于KLF4與p300的相互作用及KLF4被p300乙酰化，乙?；蚄LF4對mfn-2啟動子的激活作用顯著增強。
　　 結(jié)論
　　 1.KLF4介導(dǎo)ATRA誘導(dǎo)的mfn-2表達是通過與mfn-2啟動子區(qū)的KLF4

18、結(jié)合位點相互作用而實現(xiàn)的。同時，KLF4介導(dǎo)ATRA對核周線粒體成簇及線粒體去極化的誘導(dǎo)作用。
　　 2.ATRA通過激活JNK和p38MAPK信號途徑而誘導(dǎo)KLF4磷酸化，磷酸化型KLF4與p300相互作用增強并被p300乙?；?。KLF4乙酰化是ATRA激活mfn-2啟動子的重要條件。
　　 3.ATRA通過誘導(dǎo)KLF4磷酸化而促進KLF4與RARα的結(jié)合，二者的結(jié)合有利于KLF4與p300相互作用，進而促進KLF4乙