全反式維甲酸及衍生物ATPR對(duì)胃癌的治療作用及機(jī)制研究.pdf

1、胃癌是嚴(yán)重影響人們身體健康的常見惡性腫瘤之一,除了外科手術(shù)及放療外,細(xì)胞毒類藥物化療是胃癌治療的重要手段,但由于治療作用缺乏特異性以及長(zhǎng)期用藥導(dǎo)致的耐藥性,影響了細(xì)胞毒類藥物的治療效果,從而限制了其臨床應(yīng)用。目前,胃癌患者總的預(yù)后改善有限,進(jìn)展期胃癌患者術(shù)后五年生存率除日本外仍在30℅左右。
　　惡性腫瘤細(xì)胞由于基因調(diào)控異常,細(xì)胞分化成熟障礙,因而表現(xiàn)出無(wú)限增殖的特性。20世紀(jì)70年代,Sachs發(fā)現(xiàn)在抑制增殖和誘導(dǎo)分化的物質(zhì)作用

2、下,小鼠白血病細(xì)胞系的異常分化是可逆的,并由此提出了分化治療(differentiation therapy)的概念,作為惡性腫瘤治療的新型治療方法,誘導(dǎo)分化治療已經(jīng)引起廣泛關(guān)注。
　　全反式維甲酸(all trans retinoic acid, ATRA)是臨床常用的分化誘導(dǎo)劑,可與細(xì)胞核內(nèi)維甲酸受體(RARs)或維甲酸X受體(RXRs)結(jié)合,進(jìn)一步作用于DNA基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)維甲酸反應(yīng)原件(RARE),調(diào)節(jié)基因表達(dá),引起細(xì)胞

3、生長(zhǎng)抑制,誘導(dǎo)細(xì)胞分化或凋亡,發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。目前,ATRA已成為治療急性早幼粒細(xì)胞白血病首選藥物,并廣泛應(yīng)用于乳腺癌、甲狀腺癌、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌及宮頸癌等實(shí)體腫瘤的預(yù)防和治療,但維甲酸類化合物對(duì)胃癌的治療作用尚處于研究階段。而且ATRA誘導(dǎo)分化治療急性早幼粒細(xì)胞白血病過(guò)程中可出現(xiàn)維甲酸綜合征等副作用,或無(wú)效及耐藥,限制了臨床進(jìn)一步應(yīng)用。因而,開發(fā)療效更好、副作用更少的維甲酸類化合物已經(jīng)成為誘導(dǎo)分化治療的熱點(diǎn)之一。本課題組前期研究

4、中以ATRA為先導(dǎo)化合物合成了系列全反式維甲酸衍生物并進(jìn)行了抗腫瘤活性篩選,其中4-氨基-2三氟甲基苯基維甲酯(4-anino-2-trifluoromethyl-phenyl retimate,ATPR)對(duì)白血病細(xì)胞具有良好的誘導(dǎo)分化作用。
　　本課題在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察全反式維甲酸對(duì)胃癌的治療作用,并探討全反式維甲酸的衍生物ATPR對(duì)胃癌細(xì)胞的作用及機(jī)制,旨在為開發(fā)高效低毒的維甲酸衍生物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的:

5、
　　1.探討胃癌RARs/RXRs表達(dá)及維甲酸治療對(duì)胃癌患者手術(shù)后預(yù)后的影響
　　2.探討ATRA的衍生物ATPR對(duì)胃癌細(xì)胞的作用及機(jī)制,為胃癌誘導(dǎo)分化治療尋找新的藥物。
　　方法:
　　1.免疫組化法分析胃癌組織中RARs/RXRs表達(dá),Pearson’sc2檢驗(yàn)分析其與胃癌臨床病理因素的相關(guān)性,Cox回歸分析147例胃癌患者術(shù)后總生存時(shí)間的影響因素,進(jìn)一步應(yīng)用Kaplan–Meier法分析147例胃癌患者術(shù)

6、后總生存時(shí)間與RARa陽(yáng)性表達(dá)關(guān)系
　　2.對(duì)入選80例胃癌患者進(jìn)行維甲酸治療臨床試驗(yàn):維甲酸口服,45mg/m2,共六月,Kaplan–Meier法及壽命表法分析維甲酸治療對(duì)胃癌患者生存時(shí)間的影響。
　　3.Western-blotting法檢測(cè)三株胃癌細(xì)胞:MKN-45、MKN-74、NCI-N87RARs/RXRs表達(dá)
　　4.MTT法分析ATPR對(duì)胃癌細(xì)胞(MKN-45、MKN-74、NCI-N87的作用。

7、r>　　5.熒光素酶報(bào)告基因分析ATPR對(duì)RAR或RXR結(jié)合的選擇性。
　　6.流式細(xì)胞分析ATPR或ATRA作用胃癌細(xì)胞MKN-45、MKN-74、NCI-N8772小時(shí)后對(duì)細(xì)胞周期、凋亡的影響。
　　7.Western-blotting法檢測(cè)ATPR5 uM作用胃癌細(xì)胞MKN-45、MKN-74、NCI-N8772小時(shí)后對(duì)癌胚抗原(CEA)表達(dá)的影響。
　　8.實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western-blotting法

8、檢測(cè)ATRA及ATPR對(duì)胃癌細(xì)胞RARs/RXRs表達(dá)的影響。
　　9.分光光度法檢測(cè)ATPR5 uM作用胃癌細(xì)胞MKN-45、MKN-74、NCI-N8772小時(shí)后對(duì)堿性磷酸酶(ALP)和Kaplan–Meier法乳酸脫氫酶(LDH)活性影響。
　　結(jié)果:
　　1.RARs/RXRs在正常胃粘膜組織、胃癌組織及胃癌細(xì)胞株中均有表達(dá),RXRβ在胃癌及正常粘膜組織中均較少表達(dá),免疫組化未見強(qiáng)陽(yáng)性;胃癌中RARs與RXRs

9、的之間表達(dá)有正相關(guān)性。
　　2.RARβ、RARγ、RXRa與胃癌AJCC的TNM分期相關(guān),分期越晚其表達(dá)越低(P<0.05);RARa,RARβ與胃癌分化程度有關(guān),分化越差表達(dá)越低(P<0.05)。
　　3.RARa與AJCC的TNM分期是胃癌獨(dú)立預(yù)后因素,RARa陽(yáng)性表達(dá)胃癌患者,其總生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)(hazard rate,HR=0.42),口服維甲酸治療六月能顯著延長(zhǎng)胃癌患者手術(shù)后總生存時(shí)間(HR=0.41)。

10、>　　4.ATPR對(duì)胃癌細(xì)胞MKN45、MKN74、NCI-N87有明顯生長(zhǎng)抑制作用(P<0.05),其抗腫瘤作用呈時(shí)間及劑量依賴性,用藥48后效應(yīng)明顯,用藥72小時(shí)ATPR對(duì)胃癌細(xì)胞增殖抑制的IC50是3.0uM~6.2 uM,ATRA對(duì)胃癌細(xì)胞增殖抑制的IC50在6.6uM~8.5uM。在100uM時(shí)對(duì)正常細(xì)胞SVHUC細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)明顯低于ATRA對(duì)SVHUC細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)。
　　5.熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果表明,發(fā)光值

11、(RARE-TK-LUC+RARa+ATPR)大于發(fā)光值(RARE-TK-LUC+RARa)、發(fā)光值(RARE-TK-LUC+RXRa)及發(fā)光值(RARE-TK-LUC+RXRa+ATPR)(P<0.05),提示ATPR與RAR結(jié)合的選擇性更好,ATPR是與RAR結(jié)合,而不與RXR結(jié)合。
　　發(fā)光值(RARE-TK-LUC+RXRa+RARa+ATPR)大于發(fā)光值(RARE-TK-LUC+RARa+ATPR)(P<0.05),提示

12、ATPR與RAR/RXR異二聚體結(jié)合力大于ATPR單獨(dú)與RAR的結(jié)合力。
　　6.ATPR(5,10uM)體外給藥72h,可導(dǎo)致NCI-N87胃癌細(xì)胞subG1期細(xì)胞顯著增多(P<0.05);ATPR(10uM)體外給藥72h,可導(dǎo)致MNK-45及MKN-74細(xì)胞subG1細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.05)。
　　7.ATPR(5uM)體外給藥72h,MKN-45、MKN-74和NCI-N87胃癌細(xì)胞的凋亡細(xì)胞率分別為36.8％

13、、41.3%及46.5%。ATRA(5uM)體外給藥72h,MKN-45、MKN-74和NCI-N87凋亡細(xì)胞率分別36.0%、36.1%及35.7%。
　　8.與對(duì)照組比較,ATPR(5uM)體外用藥72h可導(dǎo)致MKN-45和MKN-74細(xì)胞CEA表達(dá)顯著減少(P<0.05),但對(duì)NCI-N87細(xì)胞CEA表達(dá)無(wú)顯著影響(P>0.05)。
　　9.與對(duì)照組比較,ATPR(5uM)體外用藥72h,MKN-45、MKN-74、N

14、CI-N87胃癌細(xì)胞的RARa mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)。
　　10.與用藥前比較,ATPR(5uM)體外用藥72h后MKN-45、MKN-74、NCI-N87胃癌細(xì)胞的RARa蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。
　　11.與對(duì)照組比較,ATPR(5uM)體外用藥72h,MKN-45、MKN-74、NCI-N87胃癌細(xì)胞中堿性磷酸酶(ALP)和乳酸脫氫酶(LDH)活力顯著降低(P<0.05),且與ATRA比較,A

15、TPR處理后引起ALP及LDH的活力降低更顯著(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.RARa是胃癌的陽(yáng)性預(yù)后因子,可作為胃癌細(xì)胞分化的標(biāo)志物之一,RARa表達(dá)陽(yáng)性胃癌患者聯(lián)合維甲酸治療可以有效延長(zhǎng)胃癌患者手術(shù)后生存期,ATRA對(duì)胃癌有一定的治療作用。
　　2.ATRA及其衍生物ATPR具有抗胃癌作用,ATPR對(duì)胃癌的治療作用機(jī)制與其誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞分化及誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡及引起胃癌細(xì)胞周期阻滯有關(guān)。在胃癌細(xì)胞分化較差時(shí),A

16、TPR更易誘導(dǎo)細(xì)胞分化,在胃癌細(xì)胞分化較好時(shí),ATPR更易誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　3.ATPR抗胃癌的分子生物學(xué)基礎(chǔ)可能是依賴維甲酸信號(hào)傳導(dǎo)通路:RAR與RXR形成異二聚體,ATPR是RAR的激動(dòng)劑,與RAR結(jié)和后形成ATPR/RAR/RXR復(fù)合物,復(fù)合物作用于基因的RARE,調(diào)節(jié)控制與細(xì)胞分化及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞分化及凋亡。
　　4.ATPR對(duì)胃癌細(xì)胞的抗腫瘤作用優(yōu)于ATRA,對(duì)正常細(xì)胞抑制作用小。在3.0~6.