KLF4在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)及意義.pdf

1、膀胱癌在世界范圍內(nèi)有較高的發(fā)病率，在所有惡性腫瘤中排名第五位。同時膀胱腫瘤也是泌尿外科發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重威脅人類健康。超過95％的膀胱惡性腫瘤來源于尿路上皮細(xì)胞。膀胱癌根據(jù)其生長方式分為淺表性及浸潤性生長，在所有膀胱癌病例中，大部分為腔內(nèi)生長的淺表性腫瘤，目前廣泛應(yīng)用的治療方式主要為經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)，即使輔以膀胱灌注化療，其復(fù)發(fā)率仍然很高。術(shù)后復(fù)查進(jìn)展為浸潤型膀胱癌的幾率約為14～45％。手術(shù)治療浸

2、潤性膀胱癌主要術(shù)式為膀胱部分切除及根治性腫瘤切除術(shù)，手術(shù)范圍廣，部分患者需終身攜帶造瘺管，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。且術(shù)后復(fù)發(fā)率仍較高，約為50～70％，50％的患者術(shù)后4～5年內(nèi)死亡。因此膀胱癌的早期診斷對提高治療效果降低腫瘤死亡率有重要意義。
　　目的:本實(shí)驗(yàn)通過對正常膀胱粘膜組織及臨床病理因素不同的膀胱尿路上皮癌組織標(biāo)本進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)采用免疫組化SP法及免疫印記WesternBlotting法，測定KLF4在正常膀胱粘膜組織及不

3、同臨床病理因素膀胱尿路上皮癌組織中的表達(dá)情況，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，目的在于揭示KLF4蛋白在膀胱尿路上皮癌組織中的表達(dá)情況，及KLF4在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展及不同臨床病理因素之間的關(guān)系。
　　方法:組織標(biāo)本來源:收集2013年11月～2015年1月石家莊市第一醫(yī)院及解放軍第260醫(yī)院泌尿外科住院患者手術(shù)切除的51例膀胱癌組織及30例正常膀胱組織。51例膀胱癌組織均經(jīng)病理證實(shí)為尿路上皮癌，根據(jù)2004年WHO膀胱癌分級標(biāo)準(zhǔn)，高級別21例

4、，低級別30例，男性33例，女性18例，年齡24～79歲，平均年齡55.0歲。所有病例均為初次手術(shù)，術(shù)前未經(jīng)任何放療、化療及免疫治療。用于免疫組織化學(xué)SP法的標(biāo)本（包括51例膀胱癌組織及30例正常膀胱粘膜組織）均經(jīng)10％甲醛固定，固體石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片。用于免疫印記western blotting法的標(biāo)本（包括30例膀胱癌組織及30例正常膀胱粘膜組織）于手術(shù)切除后立即于無菌條件下放入消毒后的Eppendof管內(nèi)，放入液氮中運(yùn)送至

5、-70℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?br>　　1免疫組織化學(xué)SP法（兩步法）:應(yīng)用免疫組化SP法檢測51例膀胱尿路上皮癌組織和30例正常膀胱黏膜組織的鋅指轉(zhuǎn)錄因子KLF4蛋白的表達(dá)情況。計(jì)算KLF4在正常膀胱黏膜組織及不同臨床病理因素的膀胱尿路上皮癌組織的表達(dá)水平，制成表格并填充數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，比較KLF4在不同病理因素的膀胱尿路上皮癌組織和正常膀胱黏膜組織的表達(dá)情況，同時應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法驗(yàn)證KLF4蛋白在膀胱尿路上皮

6、癌組織不同臨床病理參數(shù)間的表達(dá)差異。以X2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以P＜0.05作為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2 Western Blotting檢測:首先制備SDS-PAGE電泳凝膠，制備正常膀胱黏膜組織及膀胱尿路上皮癌組織標(biāo)本，取上清液作為樣品，進(jìn)行蛋白含量測定。將KLF4蛋白樣品按比例加入SDS上樣緩沖液，100℃煮沸至蛋白變性，上樣，室溫60V SDS-PAGE穩(wěn)壓電泳持續(xù)3h。將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。將PVDF膜置于5％脫脂奶粉封

7、閉，進(jìn)行一抗孵育及二抗孵育，最后用化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白。用Western blotting成像分析系統(tǒng)軟件對結(jié)果進(jìn)行定量分析。
　　結(jié)果:免疫組化結(jié)果表明:KLF4在膀胱尿路上皮癌組織和正常膀胱粘膜組織中均有表達(dá)，KLF4大多呈彌漫失極性表達(dá)，呈棕黃色顆粒，位于胞質(zhì)內(nèi)，彌散分布，部分細(xì)胞出現(xiàn)胞核著色。KLF4在正常膀胱粘膜組織的陽性表達(dá)率為96.7％，在膀胱癌組織的陽性表達(dá)率為51.0％，KLF4在正常膀胱黏膜組織的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于

8、膀胱尿路上皮癌組織。非浸潤性膀胱癌組織的KLF4表達(dá)強(qiáng)度明顯高于浸潤性膀胱癌組織。高級別膀胱癌組織的KLF4表達(dá)情況明顯低于低級別膀胱尿路上皮組織。膀胱尿路上皮癌組織的KLF4表達(dá)情況在年齡、性別、臨床分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等因素下無顯著差異。
　　Western blotting區(qū)帶定量分析表明，在60例配對的膀胱尿路上皮癌及正常膀胱粘膜組織中，所有正常膀胱粘膜組織均有較強(qiáng)的KLF4表達(dá)，24例膀胱癌組織有KLF4

9、表達(dá)，6例未見表達(dá)。正常膀胱粘膜及膀胱尿路上皮癌的電泳結(jié)果見Fig.3。通過比較KLF4與β-actin條帶密度比值來確定組織中KLF4的表達(dá)情況，并對結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示正常組織的表達(dá)比配對的癌組織明顯增強(qiáng)，具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)（見Table3)，說明KLF4在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起到抑制作用。由于樣本量較少，尚未應(yīng)用Western Blotting驗(yàn)證KLF4在不同臨床病理因素間的表達(dá)情況比較。