hsa-mir-96在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)及其對(duì)膀胱尿路上皮癌生物學(xué)行為影響的研究.pdf

1、根據(jù)流行病病學(xué)和病因?qū)W研究發(fā)現(xiàn)，在人類惡性腫瘤中，膀胱癌的發(fā)病率居第九位，且在男性排名第六位，女性排在第十位之后。而在中國(guó)，男性的發(fā)病率在惡性腫瘤中居第八位，女性則排在十二位之后。膀胱癌可發(fā)生于任何年齡，甚至可見(jiàn)于兒童，但主要是中年。膀胱癌的發(fā)病因素復(fù)雜，主要包括遺傳和環(huán)境兩大類。組織學(xué)上，膀胱癌包括尿路上皮（移行）細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌和腺細(xì)胞癌，其次還有少見(jiàn)的小細(xì)胞癌，混合型，癌肉瘤及轉(zhuǎn)移性癌。其中膀胱尿路上皮細(xì)胞癌占90％以上。

2、>　　 microRNA（簡(jiǎn)稱miRNA）又稱微小RNA，是真核生物細(xì)胞中固有的一類不編碼蛋白的小分子，長(zhǎng)度為18-25nt，能夠通過(guò)與靶mRNA特異性的堿基配對(duì)引起靶mRNA的降解或者抑制其翻譯，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的調(diào)控。通過(guò)抑制下游靶基因的表達(dá)而發(fā)揮其生物學(xué)功能。miRNA可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的過(guò)程，能夠參與細(xì)胞自我更新和分化過(guò)程?？勺鳛樯飿?biāo)記物，應(yīng)用于腫瘤診斷、預(yù)后評(píng)估和靶向治療。有些miRNA分子還可作為原癌基

3、因或抑癌基因調(diào)控腫瘤。
　　 文獻(xiàn)報(bào)道[1]，在膀胱尿路上皮細(xì)胞癌中，micmRNA的測(cè)序時(shí)發(fā)現(xiàn)hsa-mir-96在膀胱尿路上皮癌中高表達(dá)。本研究采用RT-PCR，Western Blot等方法來(lái)初步探討hsa-mir-96在膀胱尿路上皮癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的分子機(jī)制，為進(jìn)一步的信號(hào)通路研究作出預(yù)測(cè)。
　　 第一章hsa-mir-96在膀胱尿路上皮細(xì)胞癌中高表達(dá)的驗(yàn)證
　　 目的:探討并驗(yàn)證hsa-mir-96在膀胱尿

4、路上皮細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義
　　 方法:采用Real-time PCR方法驗(yàn)證33例膀胱尿路上皮細(xì)胞癌及9例癌旁正常膀胱組織中hsa-mir-96的表達(dá)情況，并分析其與膀胱尿路上皮細(xì)胞癌病理分級(jí)及臨床分期的關(guān)系。
　　 結(jié)果:hsa-mir-96在膀胱尿路上皮細(xì)胞癌中的表達(dá)明顯高于癌旁正常膀胱組織(P＜0.01)。其表達(dá)與膀胱尿路上皮細(xì)胞癌的病理分級(jí)、臨床分期密切相關(guān)，隨病理分級(jí)、臨床分期的增高而其表達(dá)也升高。
　

5、　 結(jié)論:
　　 1.膀胱尿路上皮細(xì)胞癌組織中hsa-mir-96的表達(dá)高于癌旁正常膀胱組織。
　　 2.膀胱尿路上皮細(xì)胞癌組織中hsa-mir-96的表達(dá)與其病理分級(jí)明顯正相關(guān)。
　　 3.膀胱尿路上皮細(xì)胞癌臨床分期與hsa-mir-96的表達(dá)呈正相關(guān)，
　　 4.hsa-mir-96在膀胱尿路上細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用。可能作為原癌基因來(lái)調(diào)控膀胱尿路上皮細(xì)胞癌。
　　 第二章hsa

6、-mir-96對(duì)膀胱尿路上皮細(xì)胞癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響
　　 第一節(jié)篩選工具細(xì)胞及靶基因
　　 根據(jù)hsa-mir-96在膀胱細(xì)胞癌株的表達(dá)情況，篩選出高表達(dá)的細(xì)胞株作為工具細(xì)胞。
　　 目的:比較hsa-mir-96在膀胱細(xì)胞癌細(xì)胞株T24和5637細(xì)胞中的表達(dá)，篩選出作為細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)的工具細(xì)胞。同時(shí)檢測(cè)靶基因IRS1、MAP4K1、MAP2K2、MAP3K3、MAP4K4在癌細(xì)胞株的表達(dá)，挑選其中三個(gè)相對(duì)含

7、量表達(dá)高的靶基因進(jìn)入下游實(shí)驗(yàn)。
　　 方法:(1)選兩株膀胱癌細(xì)胞:T24和膀胱腫瘤細(xì)胞株5637，采用Real-time PCR方法檢測(cè)hsa-mir-96在兩株細(xì)胞中的表達(dá)，確定表達(dá)豐度合適的適用于進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞株，并結(jié)合細(xì)胞的增殖和分化特征，作為細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)的工具細(xì)胞，同時(shí)采用半定量RT-PCR檢測(cè)兩株細(xì)胞中靶基因IRS1及MAP3K(MP4K1、MAP2K2、MAP3K3、MAP4K4)的相對(duì)含量表達(dá)。以上靶基因通過(guò)

8、基因預(yù)測(cè)軟件:miRBase，TargetScan)及Microrna綜合所得，選擇其中三個(gè)表達(dá)相對(duì)含量高的靶基因進(jìn)入下游實(shí)驗(yàn)。
　　 結(jié)果:hsa-mir-96在膀胱癌細(xì)胞株T24細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于5637細(xì)胞(p＜0.01)。在T24細(xì)胞及5637細(xì)胞中，IRS1、MAP4K1、MAP2K2的相對(duì)R值較MAP3K3、MAP4K4高（相對(duì)R值是目的基因相對(duì)IOD值/內(nèi)參基因相對(duì)IOD值）。
　　 結(jié)論:
　　

9、 1.hsa-mir-96在T24細(xì)胞中表達(dá)較5637細(xì)胞有顯著性差異，故選擇T24細(xì)胞作為下游實(shí)驗(yàn)的工具細(xì)胞。
　　 2.在T24細(xì)胞及5637細(xì)胞中，IRS1、MAP4K1、MAP2K2的R值較MAP3K3、MAP4K4高，故選擇此3基因作為hsa-mir-96的靶基因。
　　 3.上述結(jié)果可知:IRS1、MAP4K1、MAP2K23個(gè)基因在T24細(xì)胞中表達(dá)高，故選擇此3基因和T24細(xì)胞進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。
　　

10、4.通過(guò)對(duì)靶基因的驗(yàn)證，提示了通過(guò)預(yù)測(cè)軟件所得的靶基因，存在假陽(yáng)性。
　　 第二節(jié)hsa-mir-96對(duì)膀胱細(xì)胞癌株T24細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　 目的:探討hsa-mir-96對(duì)膀胱細(xì)胞癌株T24細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力等生物學(xué)行為的影響
　　 方法:
　　 1、構(gòu)建hsa-mir-96抑制劑及microRNA陰性片段，并轉(zhuǎn)染到T24細(xì)胞中，采用定量PCR檢測(cè)，確認(rèn)轉(zhuǎn)染是否成功。
　　 2、M

11、TT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率，并繪制T24細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線圖。
　　 3、AV/PI雙標(biāo)法FCM檢測(cè)T24細(xì)胞的凋亡情況。
　　 4、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)觀察hsa-mir-96對(duì)T24細(xì)胞浸襲能力的影響。
　　 5、細(xì)胞分三組:A正常培養(yǎng)T24細(xì)胞;B micmRNA陰性對(duì)照組:T24細(xì)胞+microRNA陰性片段;C hsa-mir-96抑制組:T24細(xì)胞+hsa-mir-96抑制劑片段
　　 結(jié)果:
　　

12、1.構(gòu)建hsa-mir-96抑制劑及microRNA陰性片段，轉(zhuǎn)染到T24細(xì)胞，細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到80％以上可以進(jìn)行后續(xù)的檢測(cè)。
　　 2.轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的T24細(xì)胞，生長(zhǎng)速度較對(duì)照組明顯減慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。
　　 3.轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的T24細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯增加(p＜0.01)。
　　 4.細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)觀察到轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的T24細(xì)胞侵襲能力減弱(p＜0.01)。
　　 結(jié)論:<

13、br>　　 1.hsa-mir-96抑制劑能抑制T24細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　　 2.hsa-mir-96抑制劑促進(jìn)T24細(xì)胞的凋亡。
　　 3.hsa-mir-96抑制組細(xì)胞的侵襲能力降低。
　　 第三章 hsa-mir-96信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究
　　 目的:
　　 根據(jù)hsa-mir-96靶基因在T24細(xì)胞的表達(dá)情況，初步探討hsa-mir-96與靶基因的相互作用的關(guān)系，進(jìn)一步研究hsa-mir-96

14、在膀胱尿路上皮細(xì)胞癌中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　 方法:
　　 1.采用Real-time PCR檢測(cè)三基因(IRSI、 MP4K1、 MAP2K2)在T24細(xì)胞的表達(dá)情況。
　　 2.采用Western-blot檢測(cè)三基因的蛋白含量變化。
　　 3.細(xì)胞分三組:A正常培養(yǎng)T24細(xì)胞;B microRNA陰性對(duì)照組:T24細(xì)胞+microRNA陰性片段;C hsa-mir-96抑制組:T24細(xì)胞+hsa-mi

15、r-96抑制劑片段
　　 結(jié)果:
　　 1.Real-time PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)果顯示IRSI及MP4K1在3組細(xì)胞表達(dá)變化明顯(P＜0.01)，而MAP2K2在三組的表達(dá)相對(duì)含量無(wú)明顯變化。
　　 2.Western-blot結(jié)果顯示IRIRSI及MP4K1在3組細(xì)胞表達(dá)變化明顯，而MAP2K2在三組的表達(dá)相對(duì)含量無(wú)明顯變化(P＞0.05)。結(jié)論:
　　 1.IRS1在抑制劑組的表達(dá)與正常對(duì)照組及陰性對(duì)