膀胱尿路上皮癌DAPK基因的表達及其啟動甲基化的研究.pdf

1、膀胱癌(bladder cancer，BC)是世界上發(fā)病率第六位的惡性腫瘤，在我國是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，其中尿路上皮癌(urothelial cell carcinoma，UCC)占90％左右，是膀胱癌主要的組織學(xué)類型。膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial cell carcinoma,BUCC)的顯著特點是大約75-85％的初發(fā)病例都是表淺性腫瘤(Tis，Ta，T1)，超過50％的患者會出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)，除此之外，約

2、40％的患者其腫瘤的惡性程度會增加，而最終將有30％的患者將死于膀胱癌。BUCC的高復(fù)發(fā)率和進展性、術(shù)后的膀胱灌注化療和全身化療以及長期甚至終身的隨訪觀察，無疑給患者帶來身心上的巨大痛苦、增加其醫(yī)療費用，也給國家的醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)增加了巨大的經(jīng)濟和社會負擔(dān)。
　　 目前BUCC的診斷和監(jiān)測主要依靠膀胱鏡、尿脫落細胞學(xué)(urinecytology)等檢查手段，膀胱鏡檢查屬于有創(chuàng)性檢查，不可避免的會給患者造成創(chuàng)傷和痛苦，而尿脫落細胞學(xué)的

3、陽性率極低，幾乎不能作為一個較敏感和適宜的早期診斷的指標;在治療方面，傳統(tǒng)的手術(shù)治療和輔助化療的效果欠佳，BUCC的治療期待著更有效的方案。因此，研究BUCC發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)以及遺傳學(xué)機制，從分子水平上揭示膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移機制，探索BUCC的早期診斷、預(yù)后估計的無創(chuàng)性敏感指標以及基因靶向治療的理論基礎(chǔ)和可能方案，從而提高膀胱癌的臨床診療水平，是泌尿外科臨床和科研上急需解決的熱點和重要課題。
　　 近年來，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤

4、抑制基因(即抑癌基因，tumoursuppressor gene，TSG)啟動子區(qū)CpG島(CpG island，CGI)甲基化是該基因失活的重要機制，能使該基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制，被認為與許多惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展有重要聯(lián)系。CpG島異常甲基化是Knudson's“二次打擊論”的重要內(nèi)涵，也是表觀遺傳學(xué)研究的重要內(nèi)容之一。死亡相關(guān)蛋白激酶(death associated protein kinase，DAPK)基因是腫瘤抑制基因之一，定位于染

5、色體9q34.1，是一種鈣離子(Ca2+)/鈣調(diào)蛋白(CaM)依賴性的絲/蘇氨酸蛋白激酶，可通過一系列通路參與誘導(dǎo)凋亡的正向調(diào)節(jié)，在凋亡途徑中起重要作用。DAPK在多種腫瘤細胞和組織中表達缺失，且該表達缺失與其CpG島的甲基化改變密切相關(guān)，因此被認為與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。
　　 國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織和細胞中DAPK表達低下或缺失，而其基因啟動子的甲基化水平則明顯高于正常膀胱粘膜組織和細胞，在膀胱癌患者的尿液標本中可檢測

6、到DAPK基因啟動子的甲基化，且其敏感度優(yōu)于尿脫落細胞學(xué)檢查。國內(nèi)學(xué)者胡禮炳等和趙敏等分別研究DAPK啟動子甲基化狀態(tài)與膀胱癌的關(guān)系，得出的結(jié)論卻基本相反。胡禮炳等認為DAPK的表達與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展有重要聯(lián)系，并且基因啟動子CpG島的異常甲基化在調(diào)節(jié)DAPK基因的表達中發(fā)揮重要作用，DAPK基因的甲基化與腫瘤浸潤和復(fù)發(fā)有顯著的相關(guān)性，提示DAPK甲基化可以作為腫瘤預(yù)后的一個分子指標;而趙敏等認為DAPK基因啟動子在膀胱癌中的甲基化陽性

7、率較低，且與膀胱癌的分級、分期無相關(guān)性，因而在選擇分子生物學(xué)指標輔助膀胱癌早期診斷時，DAPK的甲基化檢測需慎用。
　　 本研究在臨床標本與體外細胞兩個水平研究膀胱尿路上皮癌DAPK基因的表達及其啟動子異常甲基化的意義及其機制，探討DAPK與BUCC的發(fā)生發(fā)展是否相關(guān)、DAPK作為BUCC的早期診斷和預(yù)后估計的敏感指標，以及基因靶向治療的理論基礎(chǔ)和可能方案。本研究分為三個部分:第一部分采用Western-blot，RT-PCR和

8、MS-PCR分別檢測膀胱尿路上皮癌組織和正常膀胱粘膜上皮組織中 DAPK，DAPK mRNA的表達，以及DAPK基因啟動子CpG島的甲基化狀態(tài)，探究DAPK基因的表達與甲基化改變與BUCC的關(guān)系及其機制，以及與BUCC腫瘤臨床特點之間的關(guān)系。第二部分選擇人尿路上皮癌細胞5637進行體外實驗，將5637細胞分為2組，即膀胱尿路上皮癌細胞5637組（對照組）和膀胱尿路上皮癌細胞5637+5-Aza-CdR處理組(觀察組），分別采用Weste

9、rn-blot方法、RT-PCR方法定量檢測對照組和觀察組中DAPK、DAPK mRNA的表達，并采用MS-PCR方法檢測對照組和觀察組中DAPK基因啟動子CpG島的甲基化狀態(tài)，分析膀胱尿路上皮癌細胞中DAPK基因啟動子CpG島的甲基化狀態(tài)。第三部分采用流式細胞術(shù)和腫瘤細胞侵襲實驗分別檢測膀胱尿路上皮癌細胞5637組（對照組）及膀胱尿路上皮癌細胞5637+5-Aza-CdR處理組（觀察組）的細胞凋亡率及細胞侵襲能力，研究DAPK基因與腫

10、瘤細胞的生物學(xué)功能之間的關(guān)系。
　　 第一部分 DAPK基因的表達及其啟動子甲基化改變在人膀胱尿路上皮癌組織中的意義
　　 目的:分析DAPK基因的表達及其啟動子甲基化改變在人膀胱尿路上皮癌組織中的意義。
　　 方法:采用Western-blot方法定量檢測膀胱尿路上皮癌組織和正常膀胱粘膜上皮組織中DAPK的表達，采用RT-PCR方法定量檢測膀胱尿路上皮癌組織和正常膀胱粘膜上皮組織中DAPK mRNA的表達，并采

11、用MS-PCR方法檢測膀胱尿路上皮癌組織和正常膀胱粘膜上皮組織中DAPK基因啟動子CpG島的甲基化狀態(tài)。
　　 結(jié)果:Western-blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)DAPK在BUCC組織中表達顯著低于正常組織(P＜0.01)，且DAPK的表達與腫瘤的分級、分期無顯著相關(guān)性。RT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)DAPK mRNA在BUCC組織中表達顯著低于正常組織(P＜0.01)，且與腫瘤的分級分期無顯著相關(guān)性，與Western-blot檢測的DAPK

12、表達結(jié)果一致。MS-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)在BUCC組織中有16例檢測到DAPK基因啟動子CpG島的甲基化改變(16/21，76.2％)，在正常組織中有4例檢測到DAPK基因啟動子CpG島的甲基化改變(4/20，20％)，兩者之間具有顯著性差異(P＜0.01)。DAPK基因的甲基化改變與腫瘤病理分級、臨床分期無顯著相關(guān)性，但與肉眼血尿有關(guān)(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:(1) DAPK基因的表達缺失及其啟動子CpG島的甲基化與BUC

13、C的發(fā)生密切相關(guān)。(2) DAPK基因啟動子CpG島的甲基化與肉眼血尿有顯著的相關(guān)性，提示具有肉眼血尿的患者可能預(yù)后不良。
　　 第二部分人膀胱尿路上皮癌細胞中DAPK基因的表達及其啟動子甲基化狀態(tài)的研究
　　 目的:研究人膀胱尿路上皮癌細胞中DAPK基因的表達及其啟動子甲基化狀態(tài)，以及5-Aza-CdR對DAPK基因甲基化狀態(tài)的影響。
　　 方法:本實驗選擇人膀胱尿路上皮癌細胞5637進行體外實驗。將5637細

14、胞分為2組，即膀胱尿路上皮癌細胞5637組（對照組）和膀胱尿路上皮癌細胞5637+5-Aza-CdR處理組（觀察組），分別采用Western-blot方法、RT-PCR方法定量檢測對照組和觀察組中DAPK、DAPK mRNA的表達，并采用MS-PCR方法檢測對照組和觀察組中DAPK基因啟動子CpG島的甲基化狀態(tài)。
　　 結(jié)果:對照組5637細胞中DAPK、DAPK mRNA的表達水平極低，啟動子CpG島甲基化狀態(tài)為陽性，而觀察組

15、5637細胞中DAPK，DAPKmRNA的表達水平明顯增高，啟動子CpG島甲基化狀態(tài)為陰性。
　　 結(jié)論:(1) DAPK基因的表達異常與膀胱尿路上皮癌細胞關(guān)系密切，且基因啟動子CpG島的異常甲基化在調(diào)節(jié)DAPK基因的表達中起重要作用。(2)5-Aza-CdR可以抑制基因的甲基化，從而逆轉(zhuǎn)基因的表達，提示其可能作為一種治療腫瘤的基因靶向治療藥物。
　　 第三部分人膀胱尿路上皮癌細胞DAPK基因啟動子甲基化狀態(tài)與生物學(xué)功能

16、之間的關(guān)系分析
　　 目的:探討人膀胱尿路上皮癌細胞DAPK基因啟動子甲基化狀態(tài)與生物學(xué)功能之間的關(guān)系。
　　 方法:采用流式細胞術(shù)和腫瘤細胞侵襲實驗分別檢測膀胱尿路上皮癌細胞5637組（對照組）及膀胱尿路上皮癌細胞5637+5-Aza-CdR處理組（觀察組）的細胞凋亡率及細胞侵襲能力。
　　 結(jié)果:流式細胞術(shù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)觀察組的細胞凋亡率較對照組顯著增高。腫瘤細胞侵襲實驗檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)觀察組的細胞侵襲能力較對照組