膀胱尿路上皮癌ILK基因表達及沉默ILK基因的相關(guān)研究.pdf

1、膀胱癌(bladder cancer, BC)是發(fā)病率第六位的世界性惡性腫瘤，也是我國最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，其中尿路上皮癌(urothelial cellcarcinoma，UCC)占膀胱癌的90％左右，約50％-70％的患者會出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)。除此之外，約40％的患者其腫瘤的惡性程度會增加，而最終將有20-30％的患者將死于膀胱癌。目前BUCC的診斷和監(jiān)測主要依靠膀胱鏡、尿脫落細胞學(urine cytology)等檢查手段，膀胱鏡檢

2、查屬于有創(chuàng)性檢查，其檢測效果尚可，但會給患者造成生理創(chuàng)傷和精神痛苦，造成患者的恐懼與回避;而尿脫落細胞學檢測耗時長，陽性率不高，不適合作為一個早期檢測膀胱癌的篩查手段;在治療方面，無論是手術(shù)治療還是輔助化療，均很難達到徹底根治效果，尋找治療BUCC的新方法是時下急需解決的難題。因此，研究BUCC發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制，從分子水平上探明膀胱癌的發(fā)生、增殖、侵襲及遷移機制，發(fā)現(xiàn)BUCC的早期診斷、預(yù)后估計的無創(chuàng)性敏感指標，擬定分子靶向治療

3、的理論基礎(chǔ)和可能方案，從而提高膀胱癌的臨床診療水平，是泌尿外科臨床和科研上急需解決的熱點和重要課題。
　　整合素連接激酶(ILK)作為一個重要的信號整合器在人類癌癥發(fā)展過程的上皮間質(zhì)化(EMT)過程中起著重要的作用，但其機制尚不完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)，ILK在細胞內(nèi)有蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/AKT，PKB可以通過直接磷酸化下游蛋白底物發(fā)揮抗凋亡作用)和糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthas

4、e kinase-3β，GSK-3β)兩個催化位點，ILK能通過磷酸化PKB和GSK-3β參與到相應(yīng)的信號通路。磷酸化的PKB生物活性降低，使得細胞凋亡受抑制，使腫瘤細胞存活時間延長;GSK-3β的磷酸化導(dǎo)致細胞周期蛋白D1(cyclin D1)等基因的表達上調(diào)并影響細胞周期，促進細胞增殖;ILK的過量表達還能夠通過磷酸化PKB而誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Snail和ZEB1的表達，從而抑制E-鈣粘蛋白(E-cadherin)的表達，其在腫瘤細胞內(nèi)的

5、表達受抑可提高腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移率，促進腫瘤的侵襲和遷移;與此同時，ILK也能刺激MMP-9的表達，并通過磷酸化PKB誘導(dǎo)MMP-2的表達，促進細胞的侵襲和遷移。ILK可調(diào)配細胞外基質(zhì)及生長因子的信號傳導(dǎo)，調(diào)控細胞的生長、分化、遷移。
　　國外學者研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌細胞中ILK表達顯著升高，并能通過對E-cadherin和MMP-9表達的調(diào)節(jié)提高膀胱癌的侵襲性，而MMP-2在此過程中無明顯變化。國內(nèi)學者王德林等和朱軍等分別研究ILK與膀

6、胱癌的關(guān)系，其結(jié)果顯示ILK的表達分布與BUCC病理分級有關(guān)，而與臨床分期無關(guān)，且其通過影響E-cadherin、MMP-2和MMP-9促使腫瘤細胞侵襲遷移。結(jié)果與國外學者研究不完全一致?？偠灾壳瓣P(guān)于ILK對膀胱癌發(fā)生發(fā)展影響的研究并不充分，其中部分機制仍未研究透徹，而對于MMP-2在膀胱癌細胞遷移過程中的作用結(jié)論不統(tǒng)一。
　　本研究分為三個部分，在臨床標本與體外細胞培養(yǎng)兩個水平研究BUCC中ILK基因的表達及其意義，揭示I

7、LK與BUCC發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性:第一部分采用Western-blot，RT-PCR的方法分別檢測膀胱尿路上皮癌組織和癌旁正常膀胱組織中ILK和ILK mRNA的含量，探究ILK基因的表達與BUCC的關(guān)系，以及ILK與BUCC臨床病理特點之間的關(guān)系。第二部分選擇人尿路上皮癌T24細胞進行體外實驗，通過構(gòu)建一套瞬時轉(zhuǎn)染ILK-siRNA模型，轉(zhuǎn)染尿路上皮癌T24細胞并通過RT-PCR篩選出最有效的干擾序列，將T24細胞分為3組，即膀胱尿路上

8、皮癌T24細胞+ILK-siRNA組（目的轉(zhuǎn)染組），膀胱尿路上皮癌T24細胞組（陰性對照組）和膀胱尿路上皮癌T24細胞陰性siRNA轉(zhuǎn)染組（陰性轉(zhuǎn)染組），分別采用RT-PCR和Western-blot及免疫熒光的方法定量檢測3組細胞中ILK mRNA和ILK的表達，分析通過siRNA沉默ILK表達的模型建立是否成功。第三部分采用流式細胞術(shù)、MMT法分別檢測3組細胞的細胞增殖能力和凋亡率，進行細胞侵襲、遷移、粘附實驗，檢測3組細胞的侵襲、

9、遷移、粘附能力，最后采用Western-blot的方法分別檢測3組細胞中E-cadherin、MMP-2表達的水平。
　　第一部分人膀胱尿路上皮癌組織中ILK基因的表達及意義
　　目的:分析人膀胱尿路上皮癌組織中ILK基因的表達及其意義。
　　方法:采用Western-blot方法定量檢測膀胱尿路上皮癌組織和正常癌旁膀胱組織中ILK的表達，采用RT-PCR方法定量檢測膀胱尿路上皮癌組織和癌旁正常膀胱組織中ILK mRN

10、A的表達，并使用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。
　　結(jié)果:(1) ILK、ILK mRNA在BUCC組織中表達水平偏高，而在癌旁正常組織中其表達水平明顯較低，且兩者差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，提示ILK基因的表達上調(diào)與BUCC的發(fā)生具有顯著相關(guān)性。(2) ILK的表達與患者性別、年齡、腫瘤數(shù)目、肌層浸潤、腫瘤復(fù)發(fā)與否、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等因素均無顯著相關(guān)性，但與腫瘤分化程度相關(guān)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:(

11、1) ILK基因的表達上升與BUCC的發(fā)生密切相關(guān)。
　　(2) ILK基因的表達與BUCC的病理分級呈正相關(guān)，與其他臨床特征無明顯相關(guān)性。
　　(3) ILK基因可作為早期診斷BUCC的分子標志物，并可用于對于患者預(yù)后的評估。
　　第二部分人膀胱尿路上皮癌T24細胞中ILK基因的表達及siRNA沉默ILK基因的研究
　　目的:研究人膀胱尿路上皮癌T24細胞中ILK基因的表達，分析通過siRNA沉默ILK基因表達

12、模型的建立是否成功。
　　方法:選擇人尿路上皮癌T24細胞進行體外實驗，通過構(gòu)建一套ILK-siRNA轉(zhuǎn)染模型，轉(zhuǎn)染T24細胞并通過RP-PCR檢測出最有效的干擾序列，將T24細胞分為3組，即膀胱尿路上皮癌T24細胞+ILK-siRNA組（目的轉(zhuǎn)染組），膀胱尿路上皮癌T24細胞組（陰性對照組）和膀胱尿路上皮癌T24細胞陰性轉(zhuǎn)染組（陰性轉(zhuǎn)染組）分別采用RT-PCR和Western-blot及免疫熒光的方法定量檢測3組細胞中ILK m

13、RNA和ILK的表達。
　　結(jié)果:免疫熒光、Western-blot及RT-PCR檢測均顯示目的轉(zhuǎn)染組細胞中ILK及ILK mRNA的表達較陰性對照組和陰性轉(zhuǎn)染組顯著降低。陰性對照組和陰性轉(zhuǎn)染組細胞中ILK、ILK mRNA的表達無明顯差異。
　　結(jié)論:構(gòu)建瞬時轉(zhuǎn)染ILK-siRNA模型下調(diào)膀胱尿路上皮癌T24細胞中ILK基因的表達效果顯著。
　　第三部分沉默ILK基因與人膀胱尿路上皮癌T24細胞的生物學功能之間的關(guān)系

14、分析
　　目的:通過ILK-siRNA轉(zhuǎn)染模型驗證人膀胱尿路上皮癌細胞中ILK基因沉默與膀胱尿路上皮癌細胞生物特性之間的關(guān)系。
　　方法:采用流式細胞術(shù)、MMT法分別檢測目的轉(zhuǎn)染組、陰性對照組和陰性轉(zhuǎn)染組3組細胞的細胞增殖能力和凋亡率，進行細胞侵襲、遷移、粘附實驗，檢測3組細胞侵襲、遷移、粘附能力的不同，最后采用Western-blot的方法分別檢測3組細胞中E-cadherin、MMP-2表達的不同。
　　結(jié)果:流式

15、細胞術(shù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)目的轉(zhuǎn)染組的細胞凋亡率較其他兩組顯著增高。流式細胞術(shù)和MTT實驗結(jié)果表明目的轉(zhuǎn)染組細胞的增殖能力較其他兩組明顯下降。腫瘤細胞侵襲、遷移、粘附實驗檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)目的轉(zhuǎn)染組的細胞侵襲、遷移和粘附能力較其他兩組明顯下降，結(jié)果具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。由Western-blot法分別定量檢測3組細胞MMP-2和E-cadherin的表達水平，結(jié)果顯示降低ILK的表達能夠提高E-cadherin的表達，降低MMP-2的表達。