ANLN基因在膀胱尿路上皮癌中的作用及機制研究.pdf

1、[背景]
　　膀胱癌是我國發(fā)病率最高的泌尿系統(tǒng)腫瘤，臨床上，近半數(shù)膀胱癌患者在確診時已處于中晚期，即腫瘤已發(fā)生浸潤和轉移，臨床治療效果很差。膀胱癌根據(jù)不同病理分期，可分為非肌層浸潤性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC)以及肌層浸潤性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer，MIBC)，NMIBC以經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術為主，而MIBC則為全膀胱根治性切

2、除加淋巴結清掃術。然而，膀胱癌患者術后預后差異極大，大約60％的NMIBC患者行經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術后會復發(fā)，而MIBC患者行全膀胱根治性切除術后仍有約50％患者發(fā)生局部復發(fā)或遠處轉移。因此，對于膀胱癌發(fā)生及進展密切相關基因的分子機制及其臨床腫瘤學意義的深入研究，有助于探索膀胱癌分子分型，實現(xiàn)膀胱癌個體化治療。
　　最新高通量測序手段、生物信息學分析等手段為深入研究膀胱腫瘤的發(fā)病機制提供良好的平臺，可以有效分析腫瘤發(fā)生發(fā)展相關的信

3、號通路和關鍵靶點，為腫瘤早期診斷、個體化治療提供可行的依據(jù)。目前對于國人的膀胱癌全基因組測序相關研究尚缺乏，為此我科室膀胱癌課題研究組自2011年即開始聯(lián)合深圳華大基因研究院，運用第二代基因測序手段對膀胱癌發(fā)病機制進行了深入研究，探索膀胱癌發(fā)生及發(fā)展機制及尋找分子分型標記物。
　　[目的]
　　通過第二代基因測序探索膀胱癌與配對正常尿路上皮差異表達分子，尋找與膀胱癌發(fā)生及進展密切相關的基因，探索其在膀胱癌分子分型中的作用及其

4、在膀胱癌中的生物學功能。
　　[材料與方法]
　　1.提取10例行膀胱癌根治術患者膀胱癌組織及其配對的癌旁正常尿路上皮行轉錄組二代基因測序。通過生物信息學分析結合文獻報道，篩選出候選基因行進一步驗證及功能探討。
　　2.抽提40對膀胱癌組織及配對正常尿路上皮組織RNA行qRT-PCR，檢驗ANLN基因mRNA表達量，達并探索ANLN基因與膀胱癌分級、分期的關系。
　　3.通過公共測序信息數(shù)據(jù)庫GEO(Gene E

5、xpression Omnibus)及TCGA(TheCancer Genome Atlas，TCGA)行數(shù)據(jù)挖掘，驗證其中ANLN基因表達量與膀胱癌病理分期及預后關系。
　　4.對209例膀胱癌患者的腫瘤組織石蠟切片行免疫組化染色方法，探討ANLN編碼蛋白Anillin的表達量，比較Anillin在膀胱腫瘤組織及正常尿路上皮中表達量差異。探討Anillin表達量與膀胱癌病理分級、分期關系及其與患者預后關系。
　　5.通過q

6、RT-PCR檢測7種膀胱癌細胞系ANLN基因mRNA表達量。采用瞬轉干擾RNA（siRNA）方法對ANLN基因高表達細胞系J82及5637行基因敲減，通過CCK-8實驗檢測ANLN基因敲減對J82及5637細胞增殖能力影響。通過構建慢病毒實現(xiàn)對J82細胞系ANLN基因的穩(wěn)定敲減。利用慢病毒穩(wěn)轉J82細胞建立膀胱癌裸鼠皮下成瘤及原位膀胱腫瘤模型，通過在體動物實驗驗證ANLN基因與膀胱癌細胞增殖能力關系。
　　6.通過細胞劃痕及Tra

7、nswell小室細胞侵襲實驗探索ANLN基因敲減對膀胱癌細胞J82及5637遷移、侵襲能力的影響。
　　7.通過流式細胞術檢測探索ANLN基因敲減對膀胱癌細胞J82及5637細胞周期及凋亡影響。
　　8.通過免疫熒光染色及細胞蘇木素伊紅染色探索ANLN基因敲減對J82細胞有絲分裂及細胞形態(tài)影響。
　　9.通過基因芯片分析J82細胞ANLN敲減組與對照組差異表達基因，探索ANLN基因參與膀胱癌發(fā)生及發(fā)展的機制及其與其他信

8、號通路、基因的相互作用。
　　[結果]
　　1.10例膀胱癌組織及其配對癌旁正常尿路上皮轉錄組測序發(fā)現(xiàn)大量差異表達信號分子，本研究采用以下條件對差異表達基因進行篩選:①差異表達倍數(shù)log2-fold change≧2;②每對樣本測序RPKM值≧10;③候選基因在10對測序樣本中至少8對表達趨勢一致;④候選基因在膀胱癌組織與配對正常尿路上皮差異表達具有統(tǒng)計學意義，即probability≧0.8（相當于p值＜0.01）;⑤候選

9、基因在已有膀胱癌研究文獻中無報道。通過上述條件篩選，ANLN基因符合以上所有要求，其log2-fold change倍數(shù)為2.926; ANLN差異表達probability為0.835; ANLN在每對樣本中測序RPKM值均≧10;測序10對樣本中，ANLN在9對膀胱癌組織中表達量顯著高于配對正常尿路上皮;尚無研究報道ANLN基因在膀胱癌中有相關作用。
　　2.選取40例患者膀胱癌組織及其配對正常尿路上皮組織行qRT-PCR實驗

10、檢測ANLN基因表達量，40例患者中36例膀胱癌組織ANLN表達量顯著高于配對正常尿路上皮。將40例驗證標本按照不同病理分期及分級分類，分別分析ANLN基因表達量。ANLN基因在肌層浸潤性膀胱癌表達量明顯高于非肌層浸潤性膀胱癌，而ANLN基因表達量在高級別與低級別膀胱癌之間無明顯差異。
　　3.209例膀胱癌組織石蠟切片ANLN免疫組化染色分析發(fā)現(xiàn)肌層浸潤性膀胱癌ANLN表達量顯著高于非肌層浸潤性膀胱癌(p＜0.01)，高級別膀胱

11、癌中ANLN表達量顯著高于低級別膀胱癌(p＜0.01)?；颊咂骄S訪27.9月，高表達ANLN膀胱癌患者腫瘤特異生存時間（中位生存時間為22.4月）明顯低于ANLN低表達患者（中位生存時間為37.3月，p=0.001）;ANLN高表達患者腫瘤無進展生存時間（中位時間為19.7月）顯著低于ANLN低表達患者（中位時間為27.9月，p=0.001）;ANLN高表達患者腫瘤無復發(fā)生存時間（中位時間為17.1月）顯著低于ANLN低表達膀胱癌患者

12、(中位時間為25.2月，p=0.011)。
　　4.公共測序數(shù)據(jù)庫NCBI-GEO數(shù)據(jù)分析進一步證實ANLN基因在肌層浸潤性膀胱癌中表達量顯著高于非肌層浸潤性膀胱癌(p＜0.01)。TCGA數(shù)據(jù)庫分析則證實ANLN基因高表達患者腫瘤特異生存時間（中位生存時間14.75月）明顯低于ANLN基因低表達患者（中位生存時間36.86月，p=0.007）。
　　5.CCK-8細胞增殖實驗顯示，與陰性對照組相比，siRNA干擾ANLN基

13、因表達導致膀胱癌細胞J82與5637增殖能力顯著減弱。裸鼠皮下成瘤膀胱癌模型及原位膀胱腫瘤模型進一步證實ANLN基因敲減導致膀胱癌細胞增殖能力減弱。
　　6.劃痕實驗中，敲減ANLN基因后J82細胞與5637細胞的遷移能力較陰性對照組顯著下降。在Transwell細胞侵襲實驗中，敲減ANLN基因可以顯著抑制J82和5637細胞的侵襲能力。
　　7.與陰性對照組相比，敲減ANLN基因導致J82及5637細胞出現(xiàn)G2期阻滯，而敲

14、減ANLN基因對于J82與5637細胞凋亡則無明顯影響。Western-blot實驗證實ANLN基因敲減可導致J82與5637細胞中Cyclin B1與Cyclin D1蛋白表達降低。免疫熒光實驗顯示ANLN蛋白參與有絲分裂過程中分裂溝形成。而細胞蘇木素伊紅染色則提示ANLN基因敲減導致膀胱癌細胞有絲分裂障礙，多核膀胱癌細胞數(shù)量較對照組顯著增加。
　　8.通過對ANLN基因敲減組與陰性對照組基因表達芯片分析，ANLN敲減引起的差異

15、表達基因GO分析結果顯示其功能主要與細胞移動、遷移能力有關。而差異表達基因KEGG信號通路分析則提示ANLN基因參與膀胱癌發(fā)生及進展的過程與Jak-STAT信號通路，Toll-like信號通路，PI3K/AKT信號通路，TNF信號通路有關。
　　[結論]
　　ANLN基因及其編碼的蛋白在膀胱癌組織中高表達，且其表達水平與膀胱癌的病理分級與分期相關，ANLN高表達是膀胱癌患者不良預后的獨立危險因子。ANLN基因與膀胱癌進展密切