KLF4在2型糖尿病腎病蛋白尿發(fā)生中的作用及可能的機(jī)制.pdf

1、目的：糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是2型糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥。研究DN時(shí)蛋白尿的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，對(duì)于預(yù)防DN，以及采取針對(duì)性的措施延緩DN的發(fā)展，從而提高2型糖尿病患者的生活質(zhì)量和生活水平有著重要臨床和社會(huì)意義。
　　2型糖尿病時(shí)，足細(xì)胞之間的裂隙（slit diaphragm，SD）結(jié)構(gòu)消失，足突融合（foot process effacement），最終導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生。足細(xì)胞裂孔膜上的nephri

2、n、CD2AP，足細(xì)胞足突上的α-actin4，足細(xì)胞和腎小球基底膜之間的integrinβ1等蛋白分子的丟失都會(huì)造成足細(xì)胞損傷，導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生。
　　Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子（krüppel-like factors，KLFs）屬于核轉(zhuǎn)錄因子超家族，調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生物過(guò)程，包括增殖、分化、生長(zhǎng)、發(fā)育。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，KLF4在腎臟的發(fā)育和維持其正常生理功能中也具有重要的作用。
　　我們?cè)谇捌诘膶?shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)2型糖尿病小鼠

3、腎臟中KLF4的mRNA的表達(dá)水平顯著下降。結(jié)果初步提示，KLF4可能與2型糖尿病腎病的發(fā)生有關(guān)。阿霉素（adriamycin，ADM）誘導(dǎo)的腎病小鼠的尿蛋白水平顯著升高，同時(shí)足細(xì)胞中，KLF4和nephrin的表達(dá)也是顯著降低的。相反，增加腎病小鼠足細(xì)胞中KLF4的表達(dá)又可以升高nephrin的表達(dá)，降低尿蛋白水平。那么KLF4表達(dá)下降是否與2型糖尿病腎病蛋白尿的發(fā)生有關(guān)？其機(jī)制如何？針對(duì)這一問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)以2型糖尿病的db/db小鼠以

4、及高脂環(huán)境中的足細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究KLF4在2型糖尿病腎病蛋白尿發(fā)生中的作用及其機(jī)制，為認(rèn)識(shí)2型糖尿病腎病蛋白尿發(fā)生的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　采用db/db小鼠作為2型糖尿病動(dòng)物模型，用尾靜脈注射過(guò)表達(dá)KLF4腺病毒（Ad-GFP-KLF4）的方法改變db/db小鼠腎內(nèi)KLF4的表達(dá)水平。
　　2.細(xì)胞株
　　條件性永生化小鼠足細(xì)胞。用棕櫚酸（C16:0）模擬2型糖尿病

5、的高脂環(huán)境。用過(guò)表達(dá)KLF4腺病毒感染足細(xì)胞，改變KLF4的表達(dá)水平。
　　3.標(biāo)本收集
　　分別于第8周、12周、16周收集尿液并取腎臟組織。腎臟組織分別用于Western blot、PCR、 PAS染色、免疫組化實(shí)驗(yàn)等。
　　4.細(xì)胞收集
　　對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期足細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)濃度 BSA、C16:0、C16:0+Ad-GFP、C16:0+Ad-GFP-KLF4處理48小時(shí)后，收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot及PCR

6、分析實(shí)驗(yàn)。
　　5.Lowrry法測(cè)定小鼠24小時(shí)尿蛋白總量。
　　6.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)KLF4在2型糖尿病小鼠腎臟中的mRNA表達(dá)水平，檢測(cè)nephrin和integrinβ1在高脂環(huán)境小鼠足細(xì)胞的mRNA表達(dá)水平。
　　7.Western blot檢測(cè)KLF4在2型糖尿病小鼠腎臟中的蛋白表達(dá)水平，以及KLF4、nephrin、α-actin4和integrinβ1在高脂環(huán)境小鼠足細(xì)胞的蛋白表達(dá)水平。
　　8

7、.PAS染色觀察小鼠腎臟腎小球結(jié)構(gòu)
　　9.免疫組織化學(xué)分析2型糖尿病小鼠腎小球中nephrin、CD2AP、α-actin4、integrinβ1和integrinα3的蛋白表達(dá)水平。
　　10.數(shù)據(jù)處理
　　采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析，對(duì)所測(cè)定結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)用x±SD表示，兩組間比較用雙尾-T檢驗(yàn)分析。P<0.05為差異有顯著性意義。
　　結(jié)果：
　　1. KLF4在

8、db/db小鼠腎小球中表達(dá)下降
　　1.1.2型糖尿病小鼠的尿蛋白水平
　　與同周齡的對(duì)照組db/m小鼠（8周：5037.34±1037.73μg/24h；12周：2649.32±87.07μg/24h；16周：34605.02±16160.58μg/24h）相比，db/db小鼠在第8周（4777.18±1378.49μg/24h）時(shí)尿蛋白水平?jīng)]有明顯的變化，但隨著周齡的增加，在第12周（18629.52±3885.96μg

9、/24h，P＜0.01）和第16周（323798.60±67766.10μg/24h，P＜0.01）尿蛋白水平逐漸增高，顯著高于對(duì)照組。
　　1.2.KLF4在腎小球中的表達(dá)水平
　　PCR的結(jié)果顯示，與對(duì)照組db/m小鼠相比， db/db小鼠腎皮質(zhì)中KLF4的mRNA表達(dá)水平顯著下降。Western blot的結(jié)果顯示，與對(duì)照組db/m小鼠相比，db/db小鼠腎皮質(zhì)中KLF4蛋白表達(dá)水平顯著下降。免疫組化的結(jié)果顯示，與對(duì)照

10、組db/m小鼠（275.50±30.26）相比，db/db小鼠（150.25±15.97，P＜0.01）腎小球中KLF4表達(dá)水平顯著下降。
　　以上結(jié)果提示，腎小球KLF4表達(dá)下降可能與2型糖尿病腎病蛋白尿的發(fā)生有關(guān)。
　　2.腎小球過(guò)表達(dá)KLF4后，db/db小鼠的尿蛋白水平顯著降低
　　2.1.KLF4在腎小球中的表達(dá)水平
　　免疫組化的結(jié)果顯示，與無(wú)過(guò)表達(dá)KLF4的db/db小鼠（152.25±12.89）

11、相比，過(guò)表達(dá)KLF4的db/db小鼠腎小球中KLF4表達(dá)水平（317.5±33.25，P＜0.01）顯著上調(diào)。
　　2.2.腎小球過(guò)表達(dá)KLF4后，db/db小鼠的尿蛋白水平
　　過(guò)表達(dá)KLF4后，db/db小鼠尿蛋白水平（264330.80±33824.15μg/24h， P＜0.05）較無(wú)過(guò)表達(dá)KLF4的對(duì)照組（435255.6±10446.17μg/24h）明顯降低。
　　以上結(jié)果說(shuō)明，腎小球KLF4表達(dá)下降，是

12、2型糖尿病腎病蛋白尿發(fā)生的原因之一，增加KLF4的表達(dá)能夠改善2型糖尿病腎病尿蛋白。
　　3.KLF4可通過(guò)增加db/db小鼠腎小球中nephrin、integrinβ1和α-actin4的表達(dá)來(lái)改善2型糖尿病腎病的尿蛋白水平
　　3.1.2型糖尿病小鼠腎小球的結(jié)構(gòu)
　　PAS染色結(jié)果顯示db/db小鼠與對(duì)照組db/m小鼠的腎小球結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯差異。
　　3.2.腎小球蛋白濾過(guò)屏障關(guān)鍵蛋白， nephrin、int

13、egrinβ1、integrinα3、α-actin4和CD2AP的表達(dá)水平
　　免疫組化的結(jié)果顯示，除CD2AP和integrinα3外，db/db小鼠腎小球中nephrin（0.148±0.003，P＜0.01）、integrinβ1（0.109±0.009，P＜0.05）和α-actin4（0.136±0.001，P＜0.05）的表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組db/m小鼠（nephrin：0.208±0.016；integrinβ

14、1：0.180±0.008；α-actin4：0.159±0.007）；當(dāng)db/db小鼠過(guò)表達(dá)KLF4后，腎小球中nephrin（0.178±0.006， P＜0.01）、integrinβ1（0.164±0.006，P＜0.01）和α-actin4（0.156±0.006， P＜0.05）的表達(dá)水平顯著高于無(wú)過(guò)表達(dá)KLF4的db/db小鼠（nephrin：0.148±0.003；integrinβ1：0.109±0.009；α-act

15、in4：0.136±0.001）。
　　與文獻(xiàn)報(bào)道相符，integrinβ1、integrinα3、α-actin4和CD2AP在腎小管中也有表達(dá)。與對(duì)照組db/m小鼠相比，db/db小鼠腎小管中α-actin4的表達(dá)較低，integrinβ1、integrinα3、和CD2AP的表達(dá)無(wú)明顯的差異；db/db小鼠過(guò)表達(dá)KLF4后，腎小管中integrinβ1、integrinα3、α-actin4和CD2AP的表達(dá)無(wú)明顯的變化。n

16、ephrin特異性表達(dá)在腎小球中，但在本實(shí)驗(yàn)中，在腎小管中也有少量陽(yáng)性顆粒，可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)條件不夠優(yōu)化所致。
　　以上結(jié)果說(shuō)明，2型糖尿病小鼠腎小球中nephrin、integrinβ1和α-actin4的表達(dá)水平與KLF4的表達(dá)水平有關(guān)，低表達(dá)水平的KLF4有可能通過(guò)影響nephrin、integrinβ1和α-actin4的表達(dá)下降而與2型糖尿病腎病蛋白尿的發(fā)生相關(guān)聯(lián)。另外，2型糖尿病腎病蛋白尿的發(fā)生可能還與腎小管中α-act

17、in4的表達(dá)下降有關(guān)。
　　4.在高脂環(huán)境的足細(xì)胞中，KLF4可以調(diào)節(jié)nephrin、integrinβ1的表達(dá)
　　在不同濃度的C16:0環(huán)境下，足細(xì)胞中KLF4呈濃度依賴性下降。并且發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞在C16:0濃度為250μM的高脂環(huán)境中48小時(shí)后，伴隨著KLF4的下降， nephrin和integrinβ1蛋白表達(dá)水平均顯著下降，而α-actin4的蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯的變化；對(duì)高脂環(huán)境的足細(xì)胞過(guò)表達(dá)KLF4后，nephr

18、in的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高；integrinβ1的mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯的變化，蛋白表達(dá)水平顯著升高。此結(jié)果說(shuō)明，在高脂環(huán)境的足細(xì)胞中，KLF4很可能從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)了nephrin的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)了蛋白的表達(dá)；從尚未知的途徑只影響了integrinβ1的蛋白表達(dá)。
　　以上結(jié)果說(shuō)明，2型糖尿病腎病蛋白尿的發(fā)生與KLF4表達(dá)減少有關(guān)。其可能機(jī)制：（1）與足細(xì)胞中低水平KLF4轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)nephrin的表達(dá)下降有關(guān)；（2）與足