NG2蛋白多糖在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中的作用.pdf

1、研究背景：糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)的發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)正在逐年升高。DN已經(jīng)成為歐美誘導(dǎo)終末期腎衰竭需要腎替代治療的最常見(jiàn)的原因。早期DN的主要特征為小球肥大和進(jìn)行性細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)增加，損害逐漸加重和持續(xù)性蛋白尿?qū)е履I小球硬化，腎功能惡化和慢性腎功能衰竭。.小球肥大和ECM積聚的分子機(jī)制涉及到多種因素和途徑，是目前研究的熱點(diǎn)。NG2是一種重要的硫酸軟骨

2、素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycan，CSPG)，分子結(jié)構(gòu)顯示NG2具有完整的跨膜結(jié)構(gòu)，可與胞外多種配體結(jié)合，并介導(dǎo)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此在調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞，細(xì)胞與ECM的相互作用中發(fā)揮了重要的功能。近年來(lái)研究者們發(fā)現(xiàn)NG2不僅表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)，許多間葉細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)NG2的表達(dá)，如成軟骨細(xì)胞、骨骼肌成肌細(xì)胞、表皮干細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞/周細(xì)胞以及

3、黑色素瘤細(xì)胞等。但NG2在腎臟組織中的表達(dá)、定位以及功能仍未見(jiàn)報(bào)道。
　　 目的：本課題旨在觀察NG2在大鼠腎臟中的表達(dá)和定位，以及NG2在糖尿病大鼠模型中的表達(dá)變化，探討NG2與DN腎小球肥大和ECM積聚之間的關(guān)系，從而為DN的發(fā)病機(jī)制提供新的理論，并為DN的早期防治提供新的作用靶點(diǎn)。
　　 方法：(1)雄性SD大鼠麻醉后，灌注固定，取腎臟皮質(zhì)，免疫熒光法和免疫電鏡法觀察NG2在大鼠腎臟組織中的定位。取新鮮的腎臟皮質(zhì)，

4、RT-PCR法和western blot法分別檢測(cè)NG2 mRNA和蛋白的表達(dá)。(2)鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ)65 mg/kg單次腹腔注射，復(fù)制糖尿病大鼠模型，分別于2、4、8周各處死6只。觀察腎臟組織病理學(xué)和生化指標(biāo)改變。取腎臟皮質(zhì)，免疫熒光染色，熒光定量PCR法和western blot法觀察NG2表達(dá)的變化。(3)體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1，高糖(30mmol/L)刺激24 hs后觀察NG2表達(dá)的

5、變化。構(gòu)建兩條針對(duì)NG2的shRNA真核表達(dá)載體Pgenesil-siNG21和Pgenesil-siNG22，檢測(cè)干擾效率，取效率高的質(zhì)粒進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(4)將Pgenesil-siNG2和NG2表達(dá)載體(pcDNA-NG2)轉(zhuǎn)染入HBZY-1細(xì)胞，MTT法觀察細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞儀(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)細(xì)胞周期，熒光定量PCR法觀察ECM成分collagen VI和 Laminin的表達(dá)變化。
　　

6、結(jié)果：(1)共聚焦顯微鏡和免疫電鏡觀察均發(fā)現(xiàn)正常大鼠腎臟中可見(jiàn)NG2的表達(dá)，主要定位于腎小球系膜區(qū)，包括系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)。RT-PCR法和western blot法分別檢測(cè)NG2 mRNA和蛋白的表達(dá)，結(jié)果提示正常大鼠腎臟中NG2表達(dá)水平較低。(2)STZ腹腔注射3天后，大鼠血糖>16.7mmol/L，視為達(dá)到糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，且在處死前的8周內(nèi)始終維持高血糖水平。糖尿病大鼠的血糖、腎重/體重和尿白蛋白/肌酐明顯高于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

7、(P<0.05或P<0.01)。8周糖尿病大鼠可見(jiàn)明顯的腎小球肥大和系膜區(qū)增生，平均腎小球體積為(1.29±0.11)x106μm3，與對(duì)照組(1.14±0.12)x106μm3相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；電鏡顯示糖尿病組大鼠部分足突融合，中度系膜基質(zhì)增生。免疫熒光染色顯示糖尿病大鼠NG2表達(dá)也定位于系膜區(qū)，但較正常組熒光強(qiáng)度增加；熒光定量 PCR和western blot結(jié)果顯示糖尿病大鼠NG2 mRNA和蛋白表達(dá)增高。與對(duì)應(yīng)

8、時(shí)間段對(duì)照大鼠相比，2周糖尿病大鼠NG2 mRNA水平顯著增高(138±76)[％]，達(dá)到峰值；4周和8周糖尿病大鼠也分別增高(74±40)[％]和(73±37)[％]。(3)高糖(30mmol/L)刺激HBZY-1細(xì)胞24 hs后，NG2表達(dá)水平較正常對(duì)照組和甘露醇對(duì)照組明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。構(gòu)建兩條針對(duì)NG2的shRNA(Pgenesil-siNG21和Pgenesil-siNG22)，以及隨機(jī)陰性對(duì)照Pgenes

9、il-siNC，經(jīng)酶切鑒定和DNA測(cè)序均符合設(shè)計(jì)要求。熒光定量PCR結(jié)果顯示Pgenesil-siNG21和Pgenesil-siNG22對(duì)HBZY-1細(xì)胞中NG2基因的抑制率分別為54[％]和72[％]，選取Pgenesil-siNG22做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(4)將Pgenesil-siNG22、Pgenesil-siNC、NG2表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-NG2)和空質(zhì)粒pcDNA分別轉(zhuǎn)染入HBZY-1細(xì)胞，MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示質(zhì)粒pcDNA-N

10、G2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞吸光度值(1.309±0.018)較對(duì)照組pcDNA轉(zhuǎn)染組(1.016±0.031)明顯增加，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而質(zhì)粒Pgenesil-siNG22轉(zhuǎn)染組細(xì)胞吸光度值(0.835±0.038)較對(duì)照組Pgenesil-siNC轉(zhuǎn)染組(1.021±0.049)明顯下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示NG2基因?qū)BZY-1細(xì)胞有促進(jìn)增殖的作用。FCM結(jié)果顯示質(zhì)粒pcDNA-NG2轉(zhuǎn)染組和Pgenesil-

11、siNG22轉(zhuǎn)染組細(xì)胞周期中位于S期的比例分別為17.66％和2.88％，較對(duì)照組(10.46％和10.47％)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。熒光定量PCR法結(jié)果顯示質(zhì)粒pcDNA-NG2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞α2 (VI)collagen和Laminin β1 mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而質(zhì)粒Pgenesil-siNG22轉(zhuǎn)染組細(xì)胞α2 (VI)collagen和Laminin β1 mRNA表達(dá)較對(duì)照組顯著減少

12、，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。
　　 結(jié)論：(1)NG2在大鼠腎臟中有表達(dá)，主要定位于腎小球系膜區(qū)，包括系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)。(2)糖尿病大鼠腎臟NG2表達(dá)明顯增加，并有時(shí)序性改變，2周時(shí)達(dá)到高峰，后維持較高水平至觀察的第8周。(3)體外高糖刺激腎小球系膜細(xì)胞可見(jiàn)NG2表達(dá)的升高。從沉默和過(guò)表達(dá)NG2兩方面的實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，NG2基因有促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖和ECM成分collagen VI和Laminin增生的作用。(4