miR-21在糖尿病腎病發(fā)病過程中的作用及其機制研究.pdf

1、背景：
　　糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）發(fā)生發(fā)展過程中，轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）可通過激活Smads信號通路誘導腎小管上皮細胞向間充質細胞轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的發(fā)生及腎間質細胞外基質（extracellular matrixc，ECM）的過度沉積，進而造成腎組織廣泛的纖維化[

2、1]。本課題組前期實驗結果發(fā)現(xiàn)[2-3]，隨DN病程的進展，可導致TGF-β1/Smads信號通路持續(xù)激活和微小核糖核酸-21（miR-21）表達逐漸增加，兩者均參與了EMT的發(fā)生以及ECM的沉積，從而促進纖維化的發(fā)生發(fā)展。同時，我們發(fā)現(xiàn)核轉錄共抑制因子SnoN（Ski-related novel protein N）作為TGF-β1/Smads信號通路的重要負調控因子，在DN發(fā)生發(fā)展過程中其蛋白水平的減少，可導致TGF-β1的致纖維化

3、效應增強[4]。而Ski與SnoN為同一家族的成員，其啟動子的3’UTR存在miR-21的靶位點，miR-21可通過結合到SKI基因3’UTR抑制該基因的轉錄和翻譯。但在DN發(fā)病機制中miR-21的效應是否與SnoN有關，兩者有何關聯(lián)，目前未見報道。因此，本研究擬觀察糖尿?。―M）大鼠腎組織及高糖條件下腎小管上皮細胞中miR-21和SnoN蛋白及mRNA水平的表達變化及相互影響，探討在 DN發(fā)病過程中 miR-21的作用，以及與 Sno

4、N之間的關系和可能機制，從而進一步闡明DN腎纖維化的發(fā)病機制。
　　目的：
　　觀察糖尿病（DM）大鼠腎組織及高糖條件下腎小管上皮細胞中miR-21和SnoN蛋白及mRNA的表達變化及相互影響，探討miR-21在DN發(fā)病過程中作用，以及與SnoN之間的關系和可能機制。
　　方法：
　　1.清潔級Sprague-Dawley（SD）大鼠尾靜脈注射鏈脲佐菌素（STZ）復制DM大鼠模型，并設正常對照組（NC），每組n=

5、10，于8周（w）、16w和24w分別處死各組大鼠。生化方法檢測血糖和24小時（h）尿蛋白；HE染色（hematoxylin-eosin staining）及Masson染色觀察腎組織形態(tài)變化及病理變化；免疫組織化學染色和Western blot法檢測各組大鼠腎組織SnoN、轉化生長因子-β1（TGF-β1）、Smad3、p-Smad3（Ser423/425）、E鈣黏蛋白（E-cadherin）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、纖維連

6、接蛋白（FN）和膠原蛋白Ⅲ（CollagenⅢ，ColⅢ）的表達；實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real time fluorescent quantitative-PCR，qRT- PCR)檢測miR-21和SnoN mRNA的表達。2.NRK-52E細胞株（大鼠近端腎小管上皮細胞），采用免疫細胞化學染色檢測上皮細胞標志性蛋白E-cadherin和間質細胞標志性蛋白α-SMA在NRK-52E中的表達和分布，觀察細胞形態(tài)以及生長狀態(tài)；分為以

7、下兩個組：予正常糖[DMEM(含糖5.5 mmol/L)+2%FBS]和高糖[19.5mmol/L D-glucose+ DMEM+2% FBS]環(huán)境分別培養(yǎng)NRK-52E細胞，每組細胞分別培養(yǎng)2 h、12h、24h和48h四個時間點；Western blot檢測各組細胞中SnoN、TGF-β1、Smad3、p-Smad3（Ser423/425）、E-cadherin、α-SMA的表達情況；qRT-PCR技術檢測miR-21及SnoN

8、mRNA的表達情況。3.采用免疫熒光染色或免疫熒光雙染檢測E-cadherin、α-SMA在不同糖環(huán)境NRK-52E細胞的表達和分布；通過對NRK-52E細胞進行不同質粒轉染，分別過表達miR-21或抑制miR-21作用后予正常糖或高糖培養(yǎng)48h；Western blot方法檢測高糖環(huán)境下，增加miR-21表達或抑制miR-21作用后對NRK-52E細胞SnoN、E-cadherin和Col-Ⅲ蛋白表達的影響；qRT-PCR技術檢測Sn

9、oN mRNA和Smad7 mRNA的表達。4.通過轉染敲低NRK-52E細胞SnoN表達后予正常糖或高糖培養(yǎng)48h，Western blot和qRT-PCR技術檢測轉染效率；予人重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（bone morphogenetic protein7，BMP-7）200ng/ml加入高糖同時培養(yǎng)NRK-52E細胞48h；Western blot方法檢測SnoN、E-cadherin、Col-Ⅲ蛋白的表達；qRT-PCR技術檢測m

10、iR-21的表達。
　　結果：
　　1.生化指標及腎組織形態(tài)學變化顯示 DM大鼠模型復制成功且并發(fā)DN；與NC組相比，DM組大鼠腎組織TGF-β1、p-Smad3（Ser423/425）、α-SMA蛋白表達增加而E-cadherin蛋白表達減少（p<0.05），miR-21和SnoNmRNA表達隨疾病進程呈時間依賴性增加，但SnoN蛋白表達隨疾病進展呈時間依賴性減少（p<0.05），相關性分析結果提示大鼠腎組織中 miR-2

11、1和 SnoN蛋白的表達量呈顯著負相關（r=-0.797，p<0.01）；2.與NG組相比，HG組腎小管上皮細胞TGF-β1、p-Smad3（Ser423/425）、α-SMA蛋白表達增加而E-cadherin蛋白表達的減少（p<0.05），miR-21表達和SnoN mRNA隨高糖刺激時間延長呈時間依賴性增加，而SnoN蛋白表達則呈時間依賴性減少（p<0.05），相關性分析結果提示 NRK-52E細胞中 miR-21和 SnoN蛋白的

12、表達量呈顯著負相關（r=-0.899，p<0.01）；3.NRK-52E細胞轉染pHAGE-miR-21（過表達miR-21）后高糖培養(yǎng)，高糖進一步減少 E-cadherin的表達而增加 CollagenⅢ的表達（p<0.05），且NRK-52E細胞過表達miR-21后高糖培養(yǎng)，可顯著減少SnoN、Smad7 mRNA及蛋白的表達（p<0.05）；相反，NRK-52E細胞轉染miR-21-sponge（抑制miR-21作用）后高糖培養(yǎng)，

13、可見 E-cadherin的表達增加而 CollagenⅢ的表達減少（p<0.05）；4. NRK-52E細胞轉染 SnoN shRNA后高糖培養(yǎng)，進一步減少了E-cadherin表達而增加了CollagenⅢ的表達（p<0.05），并且miR-21的表達上調；相反，若高糖培養(yǎng) NRK-52E細胞的同時加入外源性細胞因子 BMP-7，BMP-7可上調SnoN的表達，從而恢復E-cadherin的表達并下調CollagenⅢ的表達，同時可

14、減少miR-21的表達；但NRK-52E細胞轉染SnoN shRNA后予高糖和BMP-7同時培養(yǎng)，可見BMP-7上調SnoN表達、抗纖維化和抑制miR-21的效應均被削弱。
　　結論：
　　1.DM及高糖環(huán)境下，TGF-β1通過激活腎小管上皮細胞下游的Smad3信號通路，上調miR-21的表達；增多的miR-21可能通過抑制SnoN mRNA的翻譯，導致SnoN蛋白水平降低，使得TGF-β1/Smad3信號通路失去控制而過度