EGCG對(duì)糖尿病腎病的保護(hù)作用及其機(jī)制探討.pdf

1、隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活方式改變，糖尿病患病率逐漸上升，糖尿病及其并發(fā)癥已成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題。糖尿病腎病作為糖尿病并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。目前對(duì)糖尿病慢性并發(fā)癥發(fā)病機(jī)理進(jìn)行的研究日益增多，氧化應(yīng)激作為其發(fā)病機(jī)制之一，受到廣泛的關(guān)注。目前認(rèn)為糖尿病患者和糖尿病模型中均存在氧化應(yīng)激?；钚匝醭芍苯訐p傷腎臟組織外，還是許多細(xì)胞因子損傷腎組織的最終介質(zhì)，甚至可作為信號(hào)分子，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。因此，在臨床工作中

2、選用合適的抗氧化劑以延緩糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展具有重要的臨床意義。 茶是日常生活中備受人們喜愛(ài)的飲料之一，是由山茶科植物芽葉加工制成的。茶葉中富含茶多酚類(lèi)物質(zhì)，眾多研究已證實(shí)茶多酚具有清除自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抗突變、抗腫瘤、抗炎、抗病毒和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等多種生物學(xué)活性和藥理效應(yīng)。其中起主要作用的活性成分是表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)，是目前已知的抗氧化作用最強(qiáng)的自

3、由基清除劑之一。其抗氧化機(jī)制主要包括兩方面：一方面，以電子供體的形式直接中和羥自由基和過(guò)氧自由基；另一方面，通過(guò)激活谷胱甘肽過(guò)氧化酶、抑制一氧化氮合酶活性起間接抗氧化作用。最近研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)存在EGCG受體，即層粘連蛋白受體(LR)，多種細(xì)胞都存在LR結(jié)合位點(diǎn)，EGCG不僅能通過(guò)LR與靶細(xì)胞作用，還能通過(guò)LR與其他受體的相互作用而發(fā)揮效應(yīng)。 本研究運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法，旨在闡明以下幾個(gè)問(wèn)題：1.EGCG對(duì)糖尿病大鼠腎臟有無(wú)保護(hù)作

4、用；2.通過(guò)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)探討糖尿病狀態(tài)下抗氧化酶活性和脂質(zhì)過(guò)氧化物含量的變化及EGCG干預(yù)后的效果；3.通過(guò)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)探討糖尿病狀態(tài)下細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和周期素激酶抑制劑p27(p27)表達(dá)量的改變及EGCG干預(yù)后的變化。 主要方法和結(jié)果： 第一部分：EGCG對(duì)糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用 方法： 3月齡SD大鼠給予鏈脲佐菌素(STZ，65mg/kg)腹腔注射，誘導(dǎo)建立糖尿病模型。實(shí)驗(yàn)分成4組：(

5、1)正常對(duì)照組(CN)；(2)糖尿病模型組(DM)；(3)EGCG干預(yù)組Ⅰ(DM模型建立后第一周EGCG干預(yù)，腹腔注射EGCG5mg/kg·d)；(4)EGCG干預(yù)Ⅱ(DM模型建立后第三周EGCG干預(yù)，腹腔注射EGCG5mg/kg·d)。檢測(cè)成模后第4w、8w、12w時(shí)24h尿蛋白排泄率，12w時(shí)處死大鼠測(cè)定血糖、血總膽固醇、血肌酐，計(jì)算腎重/體重比值、電鏡檢查、HE染色、PAS染色光鏡下運(yùn)用半自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)測(cè)量腎小球平均截面積，并計(jì)

6、算腎小球平均體積作為形態(tài)學(xué)指標(biāo)。 結(jié)果： EGCG早期干預(yù)可使糖尿病大鼠血糖、血總膽固醇和血肌酐降低，還可使糖尿病大鼠尿蛋白排泄量減少，腎重/體重比值降低，電鏡顯示腎小球基底膜增厚減輕、足突融合現(xiàn)象減少，系膜區(qū)PAS陽(yáng)性物質(zhì)沉積程度減輕，腎小球面積減少，腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)減少。而在糖尿病腎臟已出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變時(shí)即成模第3w后給藥，其干預(yù)效果較差。 第二部分：EGCG對(duì)糖尿病大鼠及高糖環(huán)境下腎系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激和同型半胱氨

7、酸(Hcy)的影響 方法： 1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分：各組大鼠予成模后第4w、8w、12w時(shí)尾靜脈取血，比色法測(cè)定糖尿病大鼠紅細(xì)胞超氧化物歧化酶(SOD)活性、全血谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性、血漿丙二醛(MDA)含量作為氧化應(yīng)激狀態(tài)的檢測(cè)指標(biāo)；第12w處死，取腎臟組織，制備勻漿，測(cè)定大鼠腎臟SOD活性、GSH-Px活性、MDA含量作為腎臟局部氧化應(yīng)激狀態(tài)的檢測(cè)指標(biāo)，同時(shí)測(cè)定血漿同型半胱氨酸含量。 2.體外實(shí)驗(yàn)

8、部分：選用大鼠腎系膜細(xì)胞株，分組：正常對(duì)照組(NG，葡萄糖5mmol·L-1)，高糖組(HG，葡萄糖30mmol·L-1)，HG+EGCG(10μg·L-1)組，HG+EGCG(20μg·L-1)組，HG+EGCG(400μg·L-1)組，甘露醇組(5mmol·L-1葡萄糖+25mmol·L-1甘露醇)。培養(yǎng)48h后，觀(guān)察培養(yǎng)液中抗氧化酶活性和脂質(zhì)過(guò)氧化物水平的改變及EGCG處理后的影響。 結(jié)果： 1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與C

9、N組大鼠比較，DM組大鼠腎皮質(zhì)MDA含量明顯增加，而腎皮質(zhì)內(nèi)抗氧化酶(AOEs)包括SOD、GSH-Px活性明顯降低。EGCG干預(yù)可使糖尿病大鼠腎臟SOD和GSH-Px活性明顯增加，并使腎皮質(zhì)MDA含量降低。其作用效應(yīng)與給藥時(shí)機(jī)和療程呈正相關(guān)。同時(shí)DM組大鼠的血漿MDA水平明顯升高，并伴有紅細(xì)胞SOD活性下降，此現(xiàn)象隨病程延長(zhǎng)有逐漸加重的趨勢(shì)，早期接受EGCG干預(yù)的糖尿病大鼠上述改變明顯改善。糖尿病模型組血漿同型半胱氨酸含量增加，而經(jīng)E

10、GCG干預(yù)后可下降。 2.體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果：大鼠腎系膜細(xì)胞處于高糖環(huán)境中時(shí)，MDA含量明顯增多、SOD活性和GSH-Px活性有所下降。經(jīng)EGCG處理后可使SOD活性升高，增加EGCG劑量后使SOD活性進(jìn)一步升高，并能使GSH-Px活性升高，MDA含量降低。 第三部分：EGCG對(duì)糖尿病大鼠及高糖環(huán)境下腎系膜細(xì)胞P27和ERK的作用 方法： 1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分：各組大鼠于12w處死，取腎組織行pERK免疫組化染色。

11、 2.體外實(shí)驗(yàn)部分：選用大鼠腎系膜細(xì)胞株，將其分為：正常對(duì)照組(NG，葡萄糖5mmol.L-1)，高糖組(HG，葡萄糖30mmol.L-1)，HG+EGCG(100μg.L-1)組，HG+EGCG(200μg.L-1)組，HG+EGCG(400μg.L-1)組，甘露醇組(5mmol.L-1葡萄糖+25mmol.L-1甘露醇)培養(yǎng)48h后，MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖情況，Westernblot檢測(cè)ERK、pERK和p27蛋白表達(dá)水平。

12、 結(jié)果： 1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分：免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示CN組pERK表達(dá)較少，陽(yáng)性染色部位主要位于胞漿；DM組大鼠免疫組化染色明顯增強(qiáng)，在腎小球和腎小管均有pERK蛋白表達(dá)增強(qiáng)；EGCG干預(yù)后，pERK蛋白免疫組化染色明顯減弱，尤以干預(yù)組Ⅰ為明顯。 2.體外實(shí)驗(yàn)部分：大鼠系膜細(xì)胞處于高糖環(huán)境時(shí)，系膜細(xì)胞增殖明顯，pERK和p27蛋白表達(dá)上調(diào)；經(jīng)EGCG處理后，系膜細(xì)胞增殖明顯減輕，pERK和p27蛋白表達(dá)下降，并呈劑量依

13、賴(lài)性。 結(jié)論： 1.EGCG能有效糾正糖尿病大鼠糖代謝、脂質(zhì)代謝紊亂，改善腎功能，延緩腎小球硬化的進(jìn)展，具有一定的腎保護(hù)作用。 2.腎組織過(guò)氧化產(chǎn)物堆積、內(nèi)在抗氧化酶活性降低在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，而EGCG能有效抑制糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)；EGCG可改善高糖環(huán)境下大鼠腎系膜細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)。 3.糖尿病大鼠腎組織pERK蛋白水平升高是糖尿病進(jìn)展的重要因素之一，p27蛋白表達(dá)上調(diào)是高糖環(huán)境