miR-21在胃癌中的表達(dá)及其介導(dǎo)阿霉素耐藥中作用機(jī)制研究.pdf

1、microRNA（以下簡(jiǎn)稱miRNA）是一類長(zhǎng)度為19～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源非編碼小分子RNA，它通過(guò)與靶基因mRNA的3‘-非編碼區(qū)（3’-UTR）特異結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平導(dǎo)致基因沉默。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)miRNA在腫瘤中發(fā)揮“促癌”和“抑癌”的作用而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。闡明miRNA的功能及具體作用機(jī)制，并將它們整合到整個(gè)表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中是近幾年來(lái)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。
　　我國(guó)每年胃癌新發(fā)病例約40萬(wàn)例，是我國(guó)最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之

2、一。目前唯一證實(shí)的可能治愈胃癌的手段就是手術(shù)治療，但是仍有部分患者在術(shù)后轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，因此控制胃癌的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移及晚期胃癌患者的綜合性治療都需要化療的手段來(lái)協(xié)助實(shí)現(xiàn)。然而化療過(guò)程中的關(guān)鍵棘手的問(wèn)題就是耐藥的出現(xiàn)。因此尋找高效靈敏的分子標(biāo)志物、闡明胃癌多藥耐藥的分子機(jī)制、并探索逆轉(zhuǎn)耐藥的藥物靶點(diǎn)成為腫瘤研究領(lǐng)域的一個(gè)重要方向。
　　近幾年發(fā)現(xiàn)miRNA在胃癌的發(fā)生發(fā)展及多藥耐藥過(guò)程中也起著重要的作用。miR-21是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)在多

3、種惡性腫瘤中都表現(xiàn)出“癌基因”特性的miRNA，抑制其表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。已有研究表明，miR-21與胰腺癌、膽管細(xì)胞癌、乳腺癌等惡性腫瘤的耐藥相關(guān)，但是miR-21與胃癌化療耐藥的相關(guān)研究還少見(jiàn)報(bào)道。為進(jìn)一步探索miR-21在胃癌耐藥方面的功能及調(diào)控機(jī)制，我們對(duì)miR-21在胃癌的表達(dá)、介導(dǎo)耐藥中的功能以及其下游的靶基因進(jìn)行了研究，以期為臨床上胃癌化療耐藥的研究提供新的靶點(diǎn)。簡(jiǎn)述如下。
　　目的：探

4、討miR-21在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)差異，并明確其表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性；研究miR-21在胃癌耐藥細(xì)胞中的作用和調(diào)控機(jī)制。
　　方法：
　?。?）收集以下標(biāo)本和隨訪資料（46例初發(fā)胃癌患者手術(shù)切除標(biāo)本及其癌旁組織），QRT-PCR檢測(cè)miR-21在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)，Mann-Whitney U檢驗(yàn)和one-way ANOVA的統(tǒng)計(jì)方法研究miR-21的表達(dá)水平與胃癌各項(xiàng)臨床特征及預(yù)后的

5、相關(guān)性。
　?。?）采用濃度梯度遞增法和間歇誘導(dǎo)法成功建立誘導(dǎo)建立胃癌阿霉素耐藥細(xì)胞株SGC7901/DOX3，在此基礎(chǔ)上，檢測(cè)耐藥細(xì)胞SGC7901/DOX3與親本細(xì)胞株SGC7901中miR-21的表達(dá)。利用脂質(zhì)體Lipofectamine3000將成熟miR-21的模擬物mimics（miR-21）、阻遏物inhibitors（anti-miR-21）及相應(yīng)的陰性對(duì)照negative control RNA（miR-NC和a

6、nti-miR-NC)轉(zhuǎn)染至 SGC7901和SGC7901/DDP細(xì)胞；real-time PCR技術(shù)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率；CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖水平；AnnexinⅤ/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。
　　（3）靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)和篩選采用多個(gè)應(yīng)用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行，靶基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證采用雙熒光素酶報(bào)告法和Western Blot完成。并在臨床樣本中驗(yàn)證所篩選出的靶基因的表達(dá)，分析其與

7、miR-21的相關(guān)性。
　?。?）定量PCR和Western blot法分別檢測(cè)SGC7901/DOX3與SGC7901細(xì)胞間PTEN和TIMP3 mRNA和蛋白表達(dá)差異，CCK-8法、AnnexinⅤ/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot分別檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染干擾PTEN和TIMP3對(duì)胃癌細(xì)胞增殖凋亡的影響。
　　結(jié)果：
　?。?）miR-21在初發(fā)和復(fù)發(fā)的胃癌患者癌組織中的表達(dá)水平均顯著高于相應(yīng)的癌旁正常組織，且

8、復(fù)發(fā)的胃癌患者癌組織中比初發(fā)患者中更高。臨床病理特征研究發(fā)現(xiàn)，miR-21與胃癌組織分化程度、臨床分期及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床特征有關(guān)。
　　（2）與SGC7901細(xì)胞相比，miR-21在SGC7901/DOX3中表達(dá)增高8.5±0.887倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而且隨著耐藥濃度的提高miR-21的表達(dá)逐步上升，暗示了miR-21表達(dá)可能與胃癌細(xì)胞耐藥相關(guān)。在SGC7901/DOX3中轉(zhuǎn)染anti-miR-21能逆轉(zhuǎn)其對(duì)阿霉素的耐藥

9、性。anti-miR-21組對(duì)阿霉素的IC50為4.476±0.014μg/mL，與anti-miR-NC組（23.085±0.0639μg/mL）相比，有顯著性差異。而且，SGC7901/DOX3細(xì)胞轉(zhuǎn)染anti-miR-21和anti-miR-NC24h后加入終濃度為5.0μg/mL阿霉素培養(yǎng)48h后，anti-miR-21組的凋亡率明顯增加。同樣，在SGC7901中轉(zhuǎn)染miR-21后能明顯增加敏感株對(duì)阿霉素的耐藥性。miR-21組

10、對(duì)阿霉素的IC50為9.236±0.024μg/mL，與 miR-NC組（0.775±0.074μg/mL）相比，有顯著性差異。SGC7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21 mimics或miR-NC24h后加入終濃度為0.8μg/mL阿霉素培養(yǎng)48h后，過(guò)表達(dá)miR-21組凋亡率明顯減少，與NC組相比有明顯差異。
　　（3）軟件預(yù)測(cè)和雙熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)篩選出miR-21在胃癌細(xì)胞中的靶基因-PTEN和TIMP3。SGC7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-

11、21mimics后，PTEN和TIMP3的mRNA和蛋白均降低。SGC7901/DOX3細(xì)胞轉(zhuǎn)染anti-miR-21后，其細(xì)胞內(nèi)PTEN和TIMP3的mRNA和蛋白的表達(dá)較親本細(xì)胞SGC7901明顯更高。在胃癌組織中， PTEN和TIMP3與miR-21的水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。
　?。?）SGC7901/DOX3細(xì)胞系中PTEN和TIMP3的mRNA和蛋白的表達(dá)較親本細(xì)胞SGC7901明顯減低。在SGC7901中轉(zhuǎn)染si-PTEN或

12、si-TIMP3后能增強(qiáng)其對(duì)阿霉素的耐藥性。si-PTEN和si-TIMP3組對(duì)阿霉素的IC50分別為20.22±0.039μg/mL、18.51±0.056μg/mL，與si-NC組（4.49±0.032μg/mL）相比，有顯著性差異。
　　結(jié)論：本論文的研究工作檢測(cè)了miR-21、PTEN及TIMP3在胃癌患者中的表達(dá)水平，闡明了高表達(dá)miR-21與臨床特征及預(yù)后相關(guān)性，揭示了miR-21參與胃癌耐藥的新機(jī)制，證明了高表達(dá)mi