FoxP3在胃癌中的表達及其作用機制研究.pdf

1、背景和目的:
　　以往認為FoxP3是調節(jié)性T細胞(Treg)特異性轉錄因子，對Treg的形成和功能發(fā)揮起關鍵作用。在乳腺癌、前列腺癌、結直腸癌和胃癌等多種腫瘤中，Treg與臨床病理特征及預后評價有重要關系。目前發(fā)現(xiàn)FoxP3也在多種腫瘤細胞中表達，具有重要的臨床意義。然而，關于這兩種均表達FoxP3的淋巴細胞與腫瘤細胞之間有無相互作用及其作用方式和機制還不清楚。僅有少量文獻報道了腫瘤細胞可以促進CD4+T轉變Treg，發(fā)揮免疫逃

2、逸作用。FoxP3基因的功能作用仍不清楚，特別是在胃癌中研究還比較少，它對胃癌生物學行為影響還不明確。僅有少量研究發(fā)現(xiàn)FoxP3在乳腺癌和前列腺癌中能抑制多種癌基因的轉錄，抑制腫瘤生長。本研究的目的是檢測和分析在胃癌的發(fā)生和發(fā)展過程中FoxP3在胃癌細胞以及浸潤的淋巴細胞中的表達及臨床意義，研究胃癌細胞與淋巴細胞作用方式和機制，探討FoxP3基因對胃癌細胞生物學行為的影響及發(fā)揮作用可能的信號通路，以闡述FoxP3在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作

3、用及分子機制。
　　方法:
　　1.利用Real-time PCR和免疫組化技術檢測了FoxP3在癌前病變和胃癌組織中的mRNA轉錄和蛋白表達水平。利用免疫熒光技術檢測FoxP3蛋白在多種胃癌細胞系中的表達及分布情況。用免疫組化技術檢測胃癌組織芯片中胃癌細胞和淋巴細胞中FoxP3蛋白的表達，并統(tǒng)計分析了胃癌組織及組織芯片中腫瘤細胞和淋巴細胞FoxP3陽性表達分別與臨床病理特征的關系;用生存曲線及Cox回歸分析兩種細胞中Fox

4、P3對預后評價的意義。
　　2.建立直接共培養(yǎng)和間接共培養(yǎng)體系來模擬腫瘤微環(huán)境。活細胞工作站及MTT法檢測兩種共培養(yǎng)體系下對胃癌細胞與淋巴細胞增殖的影響。Real-time PCR及Western blot技術檢測共培養(yǎng)后胃癌細胞和淋巴細胞中FoxP3及相關分子表達變化。ELISA技術檢測不同共培養(yǎng)方式下細胞上清液中TGF-β1和TGF-β2細胞因子分泌情況。
　　3.體外，用shRNA過表達質粒轉染胃癌細胞，經(jīng)藥物篩選和單

5、克隆挑選，建立穩(wěn)定轉染細胞系。CCK-8法檢測轉染FoxP3基因后胃癌細胞系生長增殖能力的改變，TUNEL染色和流氏細胞技術檢測細胞凋亡和細胞周期情況，軟瓊脂克隆形成實驗評價FoxP3基因對胃癌細胞體外克隆形成能力影響;MTT實驗測定轉FoxP3基因后對化療藥物藥物敏感性的差異。體內，通過裸鼠皮下移植瘤成瘤實驗進一步驗證FoxP3基因對胃癌生長的影響。
　　4.Real-time PCR技術分析胃癌細胞過FoxP3基因后TGF-β

6、及相關分子的轉錄情況，ELISA技術檢測過表達FoxP3基因后一些細胞因子的分泌情況。Western blot技術檢測過表達FoxP3基因后凋亡相關蛋白的改變以及NF-κB相關信號通路分子的改變。
　　結果:
　　1.在胃癌組織中，癌細胞FoxP3主要表達于胞漿，弱表達于胞核，而淋巴細胞中FoxP3主要表達于胞核。在多種胃癌細胞系中，F(xiàn)oxP3表達于胞漿和胞核。從胃癌前病變、早期胃癌到進展期胃癌過程中，F(xiàn)oxP3 mRNA水

7、平升高(P=0.001)。在胃癌患者中，癌組織高于癌旁組織(P=0.003)。癌組織中FoxP3mRNA水平與TGF-β1(P=0.020,r=0.351),HER2(P=0.002,r=0.443)轉錄水平正相關。從癌前病變、早期胃癌到進展期胃癌過程中，癌細胞中FoxP3蛋白陽性表達率增高，與腫瘤進展程度相關（P=0.008）。腫瘤組織中癌細胞中FoxP3表達陽性與否以及Treg密度高低與年齡、性別、TNM分期和淋巴結轉移不具有相關性

8、。135例胃癌組織芯片的預后分析表明，胃癌組織中癌細胞FoxP3陽性的患者，生存時間長，預后好(P=0.042);而癌組織中Treg越多的患者，生存時間越短，預后差(P=0.034)。Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)FoxP3是預后的保護因素，而Treg是預后的危險因素。
　　2.胃癌細胞與淋巴細胞共培養(yǎng)時能抑制胃癌細胞生長，直接共培養(yǎng)較間接共培養(yǎng)更明顯。共培養(yǎng)后，胃癌細胞及淋巴細胞中FoxP3 mRNA和蛋白表達均增加，而且上清液中TGF-β

9、1，TGF-β2等細胞因子分泌增加，直接共培養(yǎng)中的細胞因子水平大于間接共培養(yǎng)。
　　3.穩(wěn)定轉染FoxP3基因后的胃癌細胞，與空載體轉染的對照組相比，生長增殖減慢，細胞凋亡增加，遷移能力減弱，對化療藥物的敏感性增強。體內實驗表明轉染FoxP3的細胞裸鼠皮下移植瘤成瘤能力減弱。
　　4.FoxP3基因上調后使促凋亡相關蛋白的表達增強，抑凋亡相關蛋白的表達減弱。同時，NF-κB經(jīng)典通路P65磷酸化減弱和非經(jīng)典通路信號相關分子的表

10、達降低。
　　結論:
　　1.FoxP3在胃癌組織中表達增高，陽性表達分布于胃癌細胞和淋巴細胞。胃癌組織中腫瘤細胞FoxP3陽性和高密度浸潤的Treg對預后評價有不同的臨床意義。
　　2.FoxP3在癌前疾病及胃癌組織中表達增高，但是腫瘤細胞中FoxP3陽性表達患者預后好，可能與FoxP3基因抑制腫瘤生長促凋亡作用，和腫瘤微環(huán)境多種分子（如TGF-β、HER2），以及與淋巴細胞之間的相互作用有關。同時，上調FoxP3對