TOLL樣受體9在胃癌中的表達(dá)及其在發(fā)病機(jī)制中作用的研究.pdf

1、胃癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,但對(duì)它的發(fā)病機(jī)制目前尚不十分清楚。已有研究證實(shí)病原體對(duì)人體感染導(dǎo)致慢性炎癥,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因?yàn)椴≡w和腫瘤細(xì)胞Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)之間的相互作用所產(chǎn)生的信號(hào)改變腫瘤微環(huán)境中多種細(xì)胞因子的水平,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和調(diào)節(jié)或影響著腫瘤細(xì)胞的生存、分化、侵襲及轉(zhuǎn)移。Toll樣受體9(Toll-like receptor9,TLR9)作為TLRs的主要成員

2、之一,主要識(shí)別細(xì)菌和病毒DNA中的CpG基序或人工合成的寡脫氧核糖核酸(CpG-oligodeoxynucleotides,CpG-ODN),已有研究證實(shí),多種腫瘤細(xì)胞表達(dá)TLR9。幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是人類胃癌的主要致病因子,1994年世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將H.pylori列為胃癌的Ⅰ類致癌因子,細(xì)菌本身含有致炎或致癌因子可能起了關(guān)鍵作用。H.pylori為一種革蘭氏陰性細(xì)菌,

3、DNA中富含有CpG-ODN,是TLR9的配體,已有研究證實(shí),H.pylori DNA能被樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)的TLR9識(shí)別,這些發(fā)現(xiàn)對(duì)H.pylori感染與胃癌發(fā)病機(jī)制的研究提供了一個(gè)新的視點(diǎn)。目前關(guān)于TLR9在胃癌組織中表達(dá)情況的報(bào)道甚少,其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系尚無(wú)相關(guān)研究。也有研究證實(shí)H.pylori與胃癌的發(fā)病有關(guān),但目前無(wú)H.pylori DNA與胃癌發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究,我們假說(shuō)由于胃組織中TLR9的表達(dá)使H.pylori通過(guò)他

4、們的成份對(duì)胃癌的形成和發(fā)展有影響,探討TLR9信號(hào)通路和H.pylori感染與胃癌發(fā)病機(jī)制的關(guān)系,以期為胃癌的臨床治療提供更多的理論依據(jù)。本研究分以下三部分進(jìn)行研究。
　　 第一部分 Toll樣受體9在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義
　　 目的:
　　 從蛋白水平研究TLR9在胃癌組織、癌旁胃組織和遠(yuǎn)癌旁胃組織中的表達(dá)情況,分析TLR9-與患者的性別、胃癌進(jìn)展程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胃癌分化程度和臨床分期等臨床病理資

5、料的相關(guān)性,探討其與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及臨床特征之間的關(guān)系。
　　 方法:
　　 本研究中采用134例胃癌組織、80例癌旁胃組織和80例遠(yuǎn)癌旁胃組織作為組織芯片,采用免疫組化法檢測(cè)TLR9蛋白的表達(dá)情況。同時(shí),我們收集了36例新鮮胃癌組織及相應(yīng)的癌旁胃組織和遠(yuǎn)癌旁胃組織標(biāo)本,用免疫印跡法(Western blot)進(jìn)一步驗(yàn)證TLR9蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 134例胃癌組織中,TLR9蛋白表達(dá)陽(yáng)性1

6、04例,陰性30例,陽(yáng)性率為77.6％,癌旁胃組織80例,TLR9蛋白表達(dá)陽(yáng)性49例,陰性31例,陽(yáng)性率為61.3％,遠(yuǎn)癌旁胃組織80例,TLR9蛋白表達(dá)陽(yáng)性32例,陰性48例,陽(yáng)性率為40％,胃癌組織TLR9蛋白的表達(dá)明顯高于癌旁胃組織和遠(yuǎn)癌旁胃組織(P<0.05),且癌旁胃組織中的TLR9表達(dá)顯著高于遠(yuǎn)癌旁胃組織(P<0.05)。胃癌組織中TLR9的表達(dá)與胃癌分化程度密切相關(guān)(P<0.05),分化越低,惡性度越高,TLR9的表達(dá)就越

7、低。且我們檢測(cè)了8例胃癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié),發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)中,轉(zhuǎn)移的胃癌細(xì)胞有TLR9的表達(dá)。在36例新鮮標(biāo)本中,Western blot方法進(jìn)一步證實(shí)了在胃癌組織上存在TLR9的表達(dá),且明顯高于癌旁胃組織和遠(yuǎn)癌旁胃組織。
　　 結(jié)論:
　　 TLR9在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁胃組織和遠(yuǎn)癌旁胃組織,且TLR9的表達(dá)與腫瘤組織分化程度有關(guān),惡性度越高,TLR9的表達(dá)就越低。
　　 第二部分 H.pylori DNA促進(jìn)S

8、GC-7901細(xì)胞Toll樣受體9表達(dá)的研究
　　 目的:
　　 研究TLR9是否在胃癌細(xì)胞株SGC7901中表達(dá)以及用CpG-ODN和兩種H.pylori(NCTC11637、NCTC12908)DNA處理后,SGC7901細(xì)胞中TLR9蛋白的表達(dá)情況。
　　 方法:
　　 分別用CpG-ODN和兩種H.pylori(NCTC11637、NCTC12908)DNA刺激SGC7901細(xì)胞,使用流式細(xì)胞分析

9、和Western blot對(duì)SGC7901細(xì)胞表達(dá)的TLR9蛋白進(jìn)行檢測(cè)。
　　 結(jié)果:
　　 在SGC-7901細(xì)胞中,沒(méi)有CpG-ODN、H.pylori DNA刺激時(shí),有少量TLR9蛋白表達(dá),經(jīng)CpG-ODN、H.pylori(NCTC11637、NCTC12908)DNA處理后,TLR9蛋白的表達(dá)明顯增加(p<0.05),且具有刺激濃度和刺激時(shí)間的依賴性。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CPG-ODN刺激組SGC-7901細(xì)胞TLR9

10、蛋白的表達(dá)顯著高于H.pylori(NCTC11637、NCTC12908)組(p<0.05),兩種不同的H.pyloriDNA刺激后,TLR9表達(dá)無(wú)明顯差異(p>0.05)。Western blot分析進(jìn)一步證實(shí)SGC7901細(xì)胞經(jīng)CpG-ODN、H.pylori(NCTC11637、NCTC12908)DNA處理后,TLR9表達(dá)明顯增加(p<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 SGC-7901細(xì)胞刺激前表達(dá)少量TLR9

11、蛋白,經(jīng)CpG-ODN、H.pylori DNA刺激后,SGC-7901細(xì)胞的TLR9蛋白表達(dá)顯著增加。
　　 第三部分 H.pylori DNA通過(guò)TLR9通路促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子TGF-β1、VEGF、MMP9和MMP2的研究
　　 目的:
　　 研究H.pylori DNA是否通過(guò)TLR9通路促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞細(xì)胞因子TGF-β1、VEGF、MMP9和MMP2的表達(dá)。
　　 方

12、法:
　　 用CpG-ODN、H.pylori(NCTC11637、NCTC12908)DNA刺激SGC-7901細(xì)胞后,通過(guò)ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子TGF-β1、VEGF、MMP9和MMP2的表達(dá)情況,并用TLR9阻斷劑Chloroquine預(yù)處理后檢測(cè)SGC-7901細(xì)胞細(xì)胞因子的表達(dá),同時(shí)應(yīng)用Western blot檢測(cè)了NF-κ BP65、P38、P42和Akt的激活情況。
　　 結(jié)果:
　　

13、 在SGC-7901細(xì)胞中,兩種H.pylori DNA和CpG-ODN刺激后,均能增加細(xì)胞因子TGF-β1、VEGF、MMP9和MMP2的表達(dá),并具有刺激濃度和時(shí)間的依賴性；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CPG-ODN刺激組四種細(xì)胞因子的表達(dá)顯著高于NCTC12908DNA刺激組(p<0.05),CpG-ODN刺激組MMP9的表達(dá)顯著高于NCTC11637DNA刺激組(p<0.05),但TGF-β1,VEGF和MMP2的表達(dá)無(wú)顯著差異(p>0.05)。

14、NCTC11637DNA刺激組TGF-β1、VEGF和MMP9三種細(xì)胞因子的表達(dá)顯著高于NCTC12908DNA刺激組(p<0.05),但MMP2的表達(dá)無(wú)顯著性差異,(p>0.05)。TLR9阻斷劑Chloroquine可以抑制四種細(xì)胞因子的上調(diào)表達(dá)。同時(shí),SGC-7901細(xì)胞經(jīng)H.pylori DNA和CpG-ODN刺激后,可激活NF-κB通路蛋白P65、MAPK通路相關(guān)蛋白p38及p42和PI3K／Akt通路相關(guān)蛋白Akt的磷酸化。