Toll樣受體在慢性阻塞性肺疾病發(fā)病機(jī)制中的作用.pdf

1、背景和目的： Toll樣受體(Toll like receptors.TLRs)可特異性識(shí)別多種病原成份，啟動(dòng)固有免疫反應(yīng)，并進(jìn)一步誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。呼吸道感染及環(huán)境暴露因素對(duì)慢性阻塞性肺疾病(COPD)的發(fā)生、發(fā)展有重要影響。作為固有免疫的重要組成部分，TLRs是連接環(huán)境暴露與適應(yīng)性免疫的重要橋梁，其在COPD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮的作用開始受到廣泛關(guān)注。現(xiàn)有研究結(jié)果提示TLRs參與COPD的病理過程和免疫應(yīng)答，但對(duì)TLRs在COP

2、D患者體內(nèi)實(shí)際表達(dá)情況和作用的研究很少。本課題在穩(wěn)定期COPD患者中，以健康不吸煙者、肺功能J下常吸煙者、慢性持續(xù)期支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)為對(duì)照，探討TLRs在COPD發(fā)生發(fā)展及炎癥特點(diǎn)中的作用；應(yīng)用A549肺上皮腫瘤細(xì)胞株，探討Th1相關(guān)細(xì)胞因子及糖皮質(zhì)激素治療對(duì)呼吸道上皮TLRs表達(dá)的調(diào)節(jié)，從而進(jìn)一步明確TLRs在COPD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮的作用。 研究對(duì)象、方法：臨床研究部分入選健康不吸煙者25例，肺功能正常吸煙者21例，穩(wěn)定

3、期COPD患者30例，慢性持續(xù)期哮喘患者30例。其中穩(wěn)定期COPD患者均為吸煙者。應(yīng)用流式細(xì)胞儀全血免疫熒光直標(biāo)法檢測(cè)所有受試者外周靜脈血CD14+單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的TLR2、TLR4表達(dá)。所有受試者均檢測(cè)肺功能，COPD患者查痰培養(yǎng)、血清C反應(yīng)蛋白(CRP)，應(yīng)用酶連免疫吸附法(ELISA)測(cè)定COPD和哮喘患者血清TNF-α、IL-8濃度。 實(shí)驗(yàn)室研究部分以A549人肺上皮腫瘤細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分別單獨(dú)應(yīng)用Th1相關(guān)細(xì)胞

4、因子IFN-γ及TNF-α、地塞米松或聯(lián)合應(yīng)用地塞米松及上述細(xì)胞因子處理細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real time PCR)法檢測(cè)A549細(xì)胞TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6表達(dá)的變化情況。 研究結(jié)果： 臨床研究部分 1.CD14+單核細(xì)胞TLR2表達(dá)強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞率顯著高于中性粒細(xì)胞(P<0.001)。CD14+單核細(xì)胞TLR2表達(dá)與TLR4表達(dá)成正相關(guān)(P<0.001)。CD14+單

5、核細(xì)胞與中性粒細(xì)胞間TLR2、TLR4表達(dá)成正相關(guān)(P<0.05)。 2.COPD患者有24例留取合格痰標(biāo)本，其中16例細(xì)菌負(fù)荷量超過105CFU/ml，以革蘭氏陰性桿菌為主；CRP均處于正常水平。 3.健康不吸煙者、肺功能正常吸煙者及穩(wěn)定期COPD患者3組比較： a.外周血CD14+單核細(xì)胞TLR2和TLR4的表達(dá)在肺功能正常吸煙者中明顯下調(diào)(P<0.05)，在穩(wěn)定期COPD患者中進(jìn)一步顯著下降(P<0.05)

6、。 b.外周血中性粒細(xì)胞TLR2表達(dá)在肺功能正常吸煙者中明顯下調(diào)(P<0.05)，在穩(wěn)定期COPD患者中有進(jìn)一步下降趨勢(shì)(P>0.05)。中性粒細(xì)胞TLR4表達(dá)情況3組間無(wú)明顯差異(P>0.05)。 c.CD14+單核細(xì)胞TLR2和TLR4的表達(dá)強(qiáng)度，中性粒細(xì)胞TLR2的表達(dá)強(qiáng)度與FEV1％預(yù)計(jì)值、FEV1/FVC比值成顯著正相關(guān)(P<0.001)。 4.慢性持續(xù)期哮喘患者CD14+單核細(xì)胞中TLR2及TLR4陽(yáng)

7、性細(xì)胞率明顯高于健康對(duì)照組(P<0.01)，中性粒細(xì)胞TLR2、TLR4的表達(dá)低于健康對(duì)照(P<0.01)。CD14+單核細(xì)胞TLR2和TLR4的表達(dá)強(qiáng)度與哮喘患者血清IgE濃度有相關(guān)的趨勢(shì)。 5.COPD患者與哮喘患者的比較： a.COPD患者外周血中性粒細(xì)胞TUR2,TLR4表達(dá)明顯高于哮喘患者(P<0.05)b.COPD患者CD14+單核細(xì)胞TLR2、 TLR4表達(dá)強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞率顯著低于哮喘患者(P<0.001)

8、。 c.COPD患者血清IL-8濃度水平顯著高于哮喘患者，血清TNF-α濃度水平則低于哮喘患者(P<0.01)。 d.外周血中性粒細(xì)胞TLR2及TLR4表達(dá)強(qiáng)度與血清IL-8濃度成正相關(guān)(P<0.01)，單核細(xì)胞TLR2及TLR4陽(yáng)性細(xì)胞率與血清TNF-β濃度成正相關(guān)(P<0.01)。 實(shí)驗(yàn)室研究部分1.IFN-γ使A549細(xì)胞TLR3表達(dá)明顯上調(diào)，達(dá)對(duì)照組的3.78倍(P<0.05)。 2.TNF-α使

9、A549細(xì)胞TLR2、TLR6出現(xiàn)輕度上調(diào)(P<0.05)，分別達(dá)到對(duì)照的1.62倍和1.22倍。 3.地塞米松使A549細(xì)胞TLR2、TLR4表達(dá)明顯上調(diào)，分別達(dá)對(duì)照的3.27及3.43倍(P<0.05)。 4.地塞米松與IFN-γ共同作用A549細(xì)胞時(shí)，TLR2表達(dá)顯著上調(diào)，達(dá)對(duì)照的6.25倍，地塞米松與TNF-α聯(lián)合作用時(shí)TLR2表達(dá)增加至對(duì)照6.09倍(P<0.05)。 5.TNF-α與IFN-γ聯(lián)合刺激

10、A549細(xì)胞時(shí)，TLR2上調(diào)達(dá)對(duì)照的3.66倍，而地塞米松與TNF-α、IFN-γ三者共同作用A549細(xì)胞時(shí)，TLR2的表達(dá)出現(xiàn)十分顯著的上調(diào)，達(dá)對(duì)照的29.81倍(P<0.05)。 結(jié)論： 1.健康人群?jiǎn)魏思?xì)胞TLR2、TLR4表達(dá)顯著高于中性粒細(xì)胞。 2.吸煙抑制單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞TLRs表達(dá)。 3.COPD患者單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞TLRs表達(dá)受到抑制，TLRs表達(dá)下調(diào)與病情進(jìn)展有關(guān)。 4.