人類內(nèi)源性抗菌肽LL-37在慢性阻塞性肺疾病發(fā)病機(jī)制中作用的研究.pdf

1、研究背景：
　　 慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)是嚴(yán)重危害人類健康的常見病和多發(fā)病，但確切發(fā)病機(jī)制尚不完全明了，造成防治上的困難。因而COPD發(fā)病機(jī)制一直是該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。COPD是一種慢性氣道炎癥性疾病，以不完全可逆的氣流受限為特征，氣流受限呈進(jìn)行性發(fā)展，是肺部對(duì)于有害顆粒或氣體的異常的炎癥反應(yīng)。近年來的研究表明，天然免疫和獲得性免疫均發(fā)揮了重要的作用

2、，但中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放的炎癥介質(zhì)和蛋白酶成分在COPD發(fā)病中的作用似乎更為突出，研究人員推測(cè)天然免疫可能與COPD炎癥損傷和組織重塑關(guān)系更為密切。人類內(nèi)源性抗菌肽LL-37作為天然免疫系統(tǒng)的重要組成成分，是機(jī)體抵抗外界刺激的第一道防線。除傳統(tǒng)的抗菌作用外，趨化活性、損傷修復(fù)、影響細(xì)胞凋亡及細(xì)胞毒性等多項(xiàng)功能日益引起人們的關(guān)注。我們?cè)谇捌谘芯炕A(chǔ)及回顧文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，推測(cè)，具有廣譜多效生物學(xué)功能的LL-37可能在COPD發(fā)病過程中發(fā)揮重

3、要作用。對(duì)其狀態(tài)的研究也有助于揭示天然免疫在COPD發(fā)病過程中的作用。
　　 目的：
　　 檢測(cè)COPD患者血清、誘導(dǎo)痰及肺組織標(biāo)本中人類內(nèi)源性抗菌肽LL-37的表達(dá)，并于細(xì)胞水平觀察人支氣管上皮細(xì)胞(BEP2D)、肺泡上皮細(xì)胞(A549)經(jīng)香煙提取物(CSE)及細(xì)菌成分脂多糖(LPS)刺激前后LL-37的表達(dá)及LL-37合成多肽對(duì)BEP2D、A549炎癥因子釋放及細(xì)胞凋亡等的影響，以探討內(nèi)源性抗菌肽LL-37在COPD

4、發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　 方法：
　　 1.選取穩(wěn)定期COPD患者28例，健康吸煙者14例，健康非吸煙者18例，采集患者空腹外周血及誘導(dǎo)痰，ELISA方法檢測(cè)血清及誘導(dǎo)痰中LL-37的水平。并行肺功能檢測(cè)，填寫圣喬治問卷以評(píng)價(jià)受試者生活質(zhì)量，行6分鐘步行試驗(yàn)以評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)耐量。2.選取因肺部腫瘤、肺大皰、肺囊腫而行手術(shù)治療的COPD患者9例，肺功能正常者10例，免疫組化方法檢測(cè)肺組織標(biāo)本LL-37的表達(dá)。3.培養(yǎng)人支氣管上皮

5、細(xì)胞(BEP2D)及肺泡上皮細(xì)胞(A549)，使用不同濃度的CSE及LPS刺激細(xì)胞，免疫熒光化學(xué)染色，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)BEP2D、A549經(jīng)CSE、LPS刺激前后LL-37蛋白的表達(dá)。4.以不同濃度的LL-37合成多肽刺激BEP2D、A549細(xì)胞，ELISA方法檢測(cè)炎癥因子白細(xì)胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的水平，流式細(xì)胞儀檢測(cè)LL-37對(duì)BEP2D、A549細(xì)胞凋亡的影響，半自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液

6、中乳酸脫氫酶(LDH)的水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.ELISA結(jié)果顯示Ⅰ+Ⅱ級(jí)COPD及Ⅲ+Ⅳ級(jí)COPD患者誘導(dǎo)痰中LL-37水平顯著高于健康非吸煙組(P<0.05)及健康吸煙組(P<0.05)。Ⅲ+Ⅳ級(jí)COPD組誘導(dǎo)痰中LL-37顯著高于Ⅰ+Ⅱ級(jí)COPD組(P<0.05)。外周血中LL-37水平于各組間未見顯著性差異。誘導(dǎo)痰中LL-37水平與患者肺功能FEV1％呈負(fù)相關(guān)(r=-0.32，P=0.01)，與6分鐘步行

7、試驗(yàn)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.27，P=0.01)，與圣喬治問卷評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.35，P=0.01)。
　　 2.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，LL-37主要表達(dá)于肺內(nèi)的氣道上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞(包括中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)和成纖維細(xì)胞；COPD組支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞及炎癥細(xì)-胞LL-37呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而對(duì)照組支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞及炎癥細(xì)胞LL-37呈弱陽(yáng)性表達(dá)。
　　 3.細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染

8、色，激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，分別經(jīng)不同濃度的CSE和LPS刺激后，BEP2D細(xì)胞、A549細(xì)胞LL-37呈顯著增強(qiáng)的陽(yáng)性表達(dá)。
　　 4.ELISA結(jié)果顯示LL-37合成多肽可促進(jìn)BEP2D、A549細(xì)胞炎癥因子IL-8的釋放(P<0.05)；流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示LL-37合成多肽可誘導(dǎo)BEP2D、A549細(xì)胞的凋亡，呈劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系；LL-37合成多肽可增加BEP2D、A549細(xì)胞LDH的分泌。
　　

9、結(jié)論：1.COPD患者誘導(dǎo)痰中升高的LL-37與患者氣流受限程度，生活質(zhì)量及運(yùn)動(dòng)耐量顯著相關(guān)，COPD患者肺組織中LL-37表達(dá)亦明顯增強(qiáng)，推測(cè)它們可能作為COPD疾病活動(dòng)和進(jìn)展的預(yù)測(cè)指標(biāo)，有可能為COPD的治療提供新的靶點(diǎn)。
　　 2.暴露于CSE、LPS的支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞LL-37的表達(dá)明顯增加；
　　 3.LL-37合成多肽可促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞炎癥因子的釋放，誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)