抗菌肽LL-37對(duì)大鼠鮑曼不動(dòng)桿菌感染創(chuàng)面抗菌作用的初步研究.pdf

1、背景:
　　隨著全球經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，交通事故、社會(huì)沖突以及自然災(zāi)害的發(fā)生越來越頻繁，機(jī)體創(chuàng)傷的發(fā)生有增無減。皮膚作為人體抵御病原菌入侵的第一道屏障，一旦遭到嚴(yán)重創(chuàng)傷（燒傷、燙傷等），某些病原菌就會(huì)趁機(jī)入侵并定植，導(dǎo)致感染及并發(fā)癥的發(fā)生。臨床創(chuàng)傷常見病原菌有銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、鮑曼不動(dòng)桿菌等。董葉麗等對(duì)自2005-2010年收治的1235例創(chuàng)傷并發(fā)創(chuàng)面感染的病原學(xué)調(diào)查中，鮑曼不動(dòng)桿菌的檢出率為7.

2、70％，更重要的是，鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥率有明顯的上升趨勢，尤其是對(duì)碳青霉烯類的耐藥性日益升高。
　　鮑曼不動(dòng)桿菌屬于非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，是一種條件致病菌，廣泛分布于自然界，是人體皮膚、呼吸道、胃腸道的正常菌群。該菌在醫(yī)院環(huán)境中分布很廣且可長期存活，對(duì)重癥監(jiān)護(hù)室病房和燒傷病房中的患者威脅很大，可導(dǎo)致各種嚴(yán)重的感染性疾病，其危險(xiǎn)因素包括重癥監(jiān)護(hù)護(hù)理、住院時(shí)間長、使用機(jī)械通氣、應(yīng)用侵入性操作技術(shù)、廣譜抗菌藥物使用、長時(shí)間使用免疫抑制劑及

3、合并嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病等。由于鮑曼不動(dòng)桿菌具有快速獲得和傳播耐藥性的能力，且耐藥機(jī)制極為復(fù)雜，加之臨床上大量使用廣譜抗菌藥物，特別是第3，4代頭孢菌素和碳青酶烯類在臨床上的廣泛應(yīng)用，為其耐藥性的產(chǎn)生和發(fā)展創(chuàng)造了有利的條件。目前鮑曼不動(dòng)桿菌幾乎對(duì)所有臨床使用的抗菌藥物耐藥，可形成耐多種抗菌藥物的鮑曼不動(dòng)桿菌，包括多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌、泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌及全耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌。根據(jù)中國細(xì)菌耐藥性監(jiān)測結(jié)果顯示，于2010～2013年間，鮑曼不動(dòng)桿菌

4、臨床檢出率為16％左右，對(duì)亞胺培南及美羅培南的耐藥率均在60％左右。而我國西南醫(yī)院從478例燒傷患者中分離得到了2748株致病菌，分析顯示鮑曼不動(dòng)桿菌占14.37％，僅次于銅綠假單胞菌(36.24％)及金黃色葡萄球菌(18.01％)，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)包括碳青霉烯類在內(nèi)的絕大部分抗生素的耐藥率在57.91％～100.00％之間，且呈逐年增加的趨勢，文中結(jié)論表示鮑曼不動(dòng)桿菌可能取代銅綠假單胞菌成為導(dǎo)致燒傷感染患者死亡的主要致病細(xì)菌。
　

5、　正是因?yàn)榻┠陙砟退庻U曼不動(dòng)桿菌逐漸增多、耐藥性增強(qiáng)，臨床上急需尋找新的抗鮑曼不動(dòng)桿菌藥物。抗菌肽(Antibacterial peptide，ABP)由生物體免疫防衛(wèi)系統(tǒng)產(chǎn)生，是抗外源性病原體致病作用的防御性多肽活性物質(zhì)，是生物體固有免疫的重要組成部分，該物質(zhì)廣泛分布于各種動(dòng)植物體內(nèi)。大量研究表明，LL-37是迄今為止在人類Cathelicidins家族中發(fā)現(xiàn)的唯一成員，主要由中性粒細(xì)胞、各種上皮細(xì)胞等產(chǎn)生，具有廣譜、高效的抗微生物

6、活性，其抗菌譜包括G+、G-菌、真菌以及部分有包膜的病毒，還有中和內(nèi)毒素、免疫調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)血管生成、促進(jìn)損傷修復(fù)等生物學(xué)功能。目前，尚未見有關(guān)局部應(yīng)用抗菌肽LL-37對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌感染創(chuàng)面作用的相關(guān)報(bào)道，也尚未見關(guān)于制備大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面鮑曼不動(dòng)桿菌感染模型的文獻(xiàn)報(bào)道，故本研究先探索、建立大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面鮑曼不動(dòng)桿菌感染模型，另外建立大鼠皮膚切除創(chuàng)面鮑曼不動(dòng)桿菌感染模型，再分別與磺胺米隆做陽性對(duì)照，初步評(píng)價(jià)LL-37對(duì)燒傷及創(chuàng)傷創(chuàng)面鮑曼

7、不動(dòng)桿菌感染的抗菌作用，為進(jìn)一步研究提供有益的參考。
　　目的:
　　1、檢測抗菌肽LL-37對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的最小抑菌濃度(MIC)及最小殺菌濃度(MBC);
　　2、建立大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面鮑曼不動(dòng)桿菌感染模型;
　　3、初步觀察局部應(yīng)用抗菌肽LL-37對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌感染大鼠燙傷創(chuàng)面的抗菌效果。
　　4、初步觀察局部應(yīng)用抗菌肽LL-37對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌感染大鼠皮膚創(chuàng)傷創(chuàng)面的抗菌效果。
　　方法:

8、　　1、測定LL-37對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的MIC及MBC:采用微量肉湯稀釋法，操作規(guī)范參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)(Clinical and LaboratoryStandards Institute，CLSI)。
　　2、建立大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面鮑曼不動(dòng)桿菌感染模型:選40只健康Wistar成年大鼠（南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），實(shí)驗(yàn)前一天先用80g/L硫化鈉將大鼠背部脫毛。用2％戊巴比妥鈉(0.2ml/100g)腹腔

9、注射麻醉后，以85℃水浴燙傷背部無毛區(qū)15s，制成深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面，面積約3cm×2cm。燙傷后10min于每只大鼠創(chuàng)面上均勻涂抹制備的鮑曼不動(dòng)桿菌菌液（含菌量為1×108 CFU/ml）0.5ml，創(chuàng)面包扎，分籠喂養(yǎng)在清潔、干燥、室溫為(24±5)℃的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。于涂布后12h、24h、48h、72h分批處死大鼠，每批隨機(jī)選擇處死10只，無菌條件下切取痂下組織，每次切取組織大小約1cm×1cm，將痂下組織剪碎后，按100mg組織加入0.9

10、ml等滲鹽水的比例進(jìn)行勻漿，勻漿后作為10-1稀釋度，再將勻漿液進(jìn)行梯度稀釋后接種于瓊脂平板上，置于37℃溫箱中孵育24h，計(jì)算每克組織的菌落克隆形成單位，每克組織細(xì)菌含量(CFU/g)=菌落數(shù)(CFU)×稀釋倍數(shù)÷組織重量(g)。造模成功標(biāo)準(zhǔn)為痂下細(xì)菌定量達(dá)到1×105 CFU/g。
　　3、觀察局部應(yīng)用抗菌肽LL-37對(duì)大鼠燙傷創(chuàng)面鮑曼不動(dòng)桿菌感染的抗菌效果:另選72只健康Wistar成年大鼠，按前述方法建立大鼠燙傷模型及創(chuàng)面

11、感染模型。隨機(jī)分為抗菌肽組、磺胺米隆組、生理鹽水對(duì)照組（以下簡稱對(duì)照組），每組24只。各組分別用含0.2g/L抗菌肽LL-37溶液、100g/L磺胺米隆溶液、生理鹽水的4層紗布濕敷，再用無菌紗布包扎，每天換藥一次。給藥后1～7d大體觀察大鼠精神、進(jìn)食及活動(dòng)情況及創(chuàng)面滲出情況;大鼠分別在給藥后1d、3d、5d、7d處死，每組每批隨機(jī)選擇處死6只，無菌條件下切取皮膚組織塊，深達(dá)肌層，大小為1cm×1cm，行病理組織切片檢查，觀察炎性細(xì)胞浸潤

12、情況。另切取痂下肌肉組織一塊，大小約1cm×1cm，然后用稀釋涂布平板法計(jì)算菌數(shù)。
　　4、觀察局部應(yīng)用抗菌肽LL-37對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌感染大鼠皮膚創(chuàng)傷創(chuàng)面的抗菌效果:取30只健康Wistar成年大鼠，麻醉后，切除背部1.5cm×1.5cm大小的全層皮膚，將鮑曼不動(dòng)桿菌菌液（含菌量為1×108 CFU/ml）0.1ml涂抹于創(chuàng)面制成感染模型，并隨機(jī)分為抗菌肽組、磺胺米隆組、生理鹽水對(duì)照組（以下簡稱對(duì)照組），每組10只。傷后3h各組分

13、別用含0.2g/L抗菌肽LL-37溶液、100g/L磺胺米隆溶液或生理鹽水的4層紗布濕敷，每天換藥1次。傷后1～3d大體觀察各組大鼠創(chuàng)面的情況;傷后3d處死大鼠，檢測痂下組織細(xì)菌定量并行HE染色觀察創(chuàng)面炎性細(xì)胞浸潤情況。
　　結(jié)果:
　　1、測得LL-37對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的MIC及MBC分別為64μg/ml、128μg/ml。
　　2、創(chuàng)面細(xì)菌鑒定結(jié)果為鮑曼不動(dòng)桿菌。大鼠深Ⅱ度燙傷后10min接種含菌量約為1×108 C

14、FU/ml的鮑曼不動(dòng)桿菌菌液0.5ml，接種后12h、24h、48h、72h分別測得痂下細(xì)菌為0.09×105 cfu/g、0.77×105 cfu/g、2.16×105 cfu/g、7.17×105cfu/g。
　　3、抗菌肽LL-37對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌感染大鼠燙傷創(chuàng)面的抗菌效果:所有實(shí)驗(yàn)大鼠至實(shí)驗(yàn)結(jié)束無1例死亡。用藥前（即接種細(xì)菌后48h），三組大鼠創(chuàng)面大部分呈蒼白色，局部有少許滲出，創(chuàng)緣紅腫?？咕慕M及對(duì)照組于3d時(shí)創(chuàng)面濕潤，創(chuàng)

15、面周圍水腫;5d大部分創(chuàng)面仍濕潤，局部形成紅褐色痂皮，創(chuàng)緣紅腫明顯，痂下肉芽組織生長不佳，肌肉組織晦暗;7d創(chuàng)面較干燥，部分創(chuàng)面形成棕褐色痂皮，創(chuàng)緣水腫較前減輕，痂下可見肉芽組織生長?；前访茁〗M3d時(shí)創(chuàng)面干燥，部分創(chuàng)面可見棕褐色痂皮形成，5d時(shí)大部分形成棕褐色痂皮，創(chuàng)面稍縮小，痂下可見肉芽組織生長，7d時(shí)痂皮顏色加深、變硬，痂下肉芽組織生長良好。細(xì)菌定量結(jié)果顯示治療后各時(shí)間點(diǎn)抗菌肽組及對(duì)照組的細(xì)菌數(shù)均多于磺胺米隆組(P＜0.05)，抗菌

16、肽組與對(duì)照組之間各時(shí)間點(diǎn)細(xì)菌數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)?；前访茁〗M1d至7d細(xì)菌數(shù)則呈逐漸遞減趨勢，抗菌肽組及對(duì)照組細(xì)菌數(shù)從傷后1d至5d逐漸增多，但7d時(shí)細(xì)菌數(shù)開始下降。HE染色顯示用藥后1d三組創(chuàng)面均可見彌漫浸潤的中性粒細(xì)胞浸潤，用藥后3d、5d、7d磺胺米隆組的均較抗菌肽組及對(duì)照組輕，5d時(shí)磺胺米隆組真皮層及皮下有少許炎性細(xì)胞浸潤，而抗菌肽組及對(duì)照組仍有大量炎性細(xì)胞浸潤。
　　4、抗菌肽LL-37對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌感染大鼠

17、皮膚創(chuàng)傷創(chuàng)面的抗菌效果:對(duì)照組大鼠相比其他兩組活動(dòng)減少，創(chuàng)面潮濕，分泌物較多;磺胺米隆組及抗菌肽組創(chuàng)面結(jié)痂、干燥、無明顯分泌物?？咕慕M細(xì)菌定量為(11.9±6.7)×102 CFU/g，磺胺米隆組為(15.2±11.4)×102 CFU/g，對(duì)照組為(68.1±36.4)×104 CFU/g，前兩組明顯低于對(duì)照組(P＜0.0)，而抗菌肽組與磺胺米隆組無顯著差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、LL-37對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌