藍(lán)光對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌殺滅作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　自1911年Beijerinek從土壤中分離出第一株不動(dòng)桿菌以來(lái)，這類(lèi)廣泛分布于自然環(huán)境，生存條件簡(jiǎn)單的革蘭陰性菌，已逐漸發(fā)展成目前醫(yī)院內(nèi)感染的重要條件致病菌之一。鮑曼不動(dòng)桿菌（Ab）是氧化酶陰性且嚴(yán)格需氧的革蘭氏陰性桿菌，其廣泛存在于自然界及院內(nèi)環(huán)境中，在一定條件下，鮑曼不動(dòng)桿菌可引起重癥監(jiān)護(hù)病房患者的呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎（VAP）、皮膚和軟組織感染、創(chuàng)面感染、泌尿系統(tǒng)感染、繼發(fā)性腦膜炎和敗血癥，且某些特殊菌群

2、常導(dǎo)致爆發(fā)性的院內(nèi)感染。隨著廣譜抗菌藥物的廣泛使用，臨床上關(guān)于鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥的報(bào)道越來(lái)越多，并呈現(xiàn)出多重耐藥，甚至全耐藥及高耐藥率的趨勢(shì)，有報(bào)道稱(chēng)近年來(lái)碳青霉烯類(lèi)抗生素的耐藥率也明顯提高，部分菌株甚至對(duì)多粘菌素、替加環(huán)素等不常用或新開(kāi)發(fā)抗生素也產(chǎn)生了明顯耐藥性。因此，臨床抗鮑曼不動(dòng)桿菌感染治療面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。最近，研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)光具有極強(qiáng)的殺菌活性：不同于光動(dòng)力療法（PDT），其殺菌作用的體現(xiàn)不需要額外光敏感劑，且對(duì)正常組織細(xì)胞無(wú)明顯毒性。

3、本文通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究藍(lán)光以不同能量作用于鮑曼不動(dòng)桿菌，并觀察分析其殺菌效果，為鮑曼不動(dòng)桿菌感染的綜合治療提供新的思路。
　　研究方法：
　　本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)以下四個(gè)方面研究藍(lán)光對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的殺滅作用：
　　1．平板劃線評(píng)價(jià)藍(lán)光殺菌活性：
　　無(wú)菌條件下，于哥倫比亞瓊脂平板兩側(cè)各取15ul細(xì)菌液劃兩條平行線，各長(zhǎng)4cm；用遮光板遮蔽其中一條平行線（Con組），另一條予以藍(lán)光照射，分組給予不同的能量密度（12 J/c

4、m2，60J/cm2，120 J/cm2和240 J/cm2）（輻射度均為60mw/cm2，根據(jù)照射時(shí)間（秒）=能量密度/輻射度”，計(jì)算不同能量密度所需要的照射時(shí)間）；分別于培養(yǎng)12h及24h后進(jìn)行觀察分析菌落的生長(zhǎng)情況。本部分實(shí)驗(yàn)采用650nm紅光作為對(duì)照。
　　2.菌落計(jì)數(shù)評(píng)價(jià)藍(lán)光殺菌活性：
　　取1×106 CFU/ml細(xì)菌液300ul混勻后加入12孔細(xì)胞培養(yǎng)板（COSTAR，USA）中，將上述菌液在3270g、4℃離

5、心10分鐘，棄除上清后給予不同的能量密度（同上）的藍(lán)光照射；非處理組（Con組）同樣離心處理但不予光照。光照過(guò)程中同樣將十二孔板置于冰塊表面，通風(fēng)并監(jiān)測(cè)溫度；光照完成后，取300ul生理鹽水分別加入十二孔板中，吹打混勻后，各取15ul細(xì)菌均勻涂在哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基表面，置于35℃，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，觀察并拍照，通過(guò)Image J軟件對(duì)菌落計(jì)數(shù)進(jìn)行定量分析；每組樣本數(shù)為6。
　　3.殺菌率測(cè)定：
　　用LIVE/DEAD

6、染色法，定量測(cè)定藍(lán)光的殺菌率：菌液前期處理及分組同上，實(shí)驗(yàn)組采用藍(lán)光照射，自12J/cm2開(kāi)始，照射能量的逐步增加，60J/cm2、120J/cm2、240J/cm2，對(duì)照組置于自然光下，不予特別光照，光照完成后分別于十二孔板中加入300ul肉湯，于35℃，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，隨后在3270g，4℃離心10分鐘，棄除上清，待染色；配置LIVE/DEAD染液（LIVE/DEAD? BacLight?Bacterial Viabilit

7、y Kit for microscopy and quantitative assays，InvitrogenTM︱Molecular Probes?，USA）：取1000ul生理鹽水于EP管中，避光條件下分別加入碘化丙啶（propidium iodide）2ul及4-[(2,5-二氯苯基)偶氮]-3-羥基-N-(4-甲基苯基)-2-萘甲酰胺（SYTO）1ul并混勻；將上述染液各取200ul分別加入各組板孔中，避光靜置15min，以32

8、70g、4℃離心10min，棄上清；用倒置熒光顯微鏡（TI-S，Nikon，日本）進(jìn)行觀察、拍照，照片通過(guò)Image J軟件分析并計(jì)算其殺菌率；
　　4.藍(lán)光殺生物膜內(nèi)鮑曼不動(dòng)桿菌的實(shí)驗(yàn)研究：
　　1）生物膜的培養(yǎng)及鑒定，將10mm*10mm的蓋玻片用洗滌沖凈，再用蒸餾水沖洗甩干；用梯度酒精（95％、90%、85%、80%、75%）各浸泡蓋玻片半小時(shí)，烘干，置于平皿內(nèi)高溫消毒后備用。將經(jīng)高溫消毒的蓋玻片置于滅菌的十二孔板三個(gè)

9、孔內(nèi)，取15ul細(xì)菌液加入900ul BHI培養(yǎng)液，并混勻，均勻加入上述十二孔板中，蓋上盒蓋，立即置于培養(yǎng)箱37℃下培養(yǎng)；每間隔48小時(shí)換液一次，至培養(yǎng)第七天；去除培養(yǎng)液，加入500ul滅菌水，輕輕晃動(dòng)約1分鐘，吸凈滅菌水，如此反復(fù)沖洗三次，待染色。2）配置生物膜內(nèi)菌體染液（FilmTracer? FM?1-43 Green Biofilm Cell Stain︱Molecular Probes?，USA）：取10ul原液加入990ul

10、二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide DMSO）中混勻，取所配溶液100ul加入900ul滅菌水中混勻；各取生物膜內(nèi)菌體染液及生物膜基質(zhì)染液(FilmTracer? SYPRO? Ruby Biofilm Matrix Stain，InvitrogenTM︱Molecular Probes?，USA）300ul加入上述待染十二孔板中，避光靜置30分鐘。取出蓋玻片，注意正面朝上，用激光共聚焦掃描顯微鏡（Confocal las

11、er scanning microscope，CLSM，Leica TCS SP2，Leica，Germany）觀察。每組樣本數(shù)為6。3）掃描電鏡觀察藍(lán)光殺生物膜內(nèi)鮑曼不動(dòng)桿菌效果及對(duì)生物膜的破壞：按以上實(shí)驗(yàn)方法培養(yǎng)細(xì)菌生物膜至第七天，滅菌水沖洗三次后，待光照。給予本實(shí)驗(yàn)最大能量密度360 J/cm2藍(lán)光進(jìn)行照射，對(duì)照組不予任何處理；完成藍(lán)光照射后，各樣本加入300ul培養(yǎng)液，置于35℃，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)。吸除培養(yǎng)液，并用滅菌水

12、沖洗三次，處理加工后于掃描電子顯微鏡（CM-120Bio Twio，PHILIP，Holland）下觀察。每組樣本數(shù)為6。
　　研究結(jié)果：
　　1.平板劃線的大體觀察：與Con組相比，自能量密度60J/cm2開(kāi)始，隨著照射能量的增加，藍(lán)光的殺菌效果遞增，12J/cm2與Con組相比殺菌效果無(wú)明顯差異。單獨(dú)的紅光照射并無(wú)殺菌效應(yīng)。
　　2.菌落計(jì)數(shù)的變化：自60J/cm2開(kāi)始，隨著藍(lán)光照射能量的增加，存活的細(xì)菌數(shù)越來(lái)越少

13、（Fig2A）；60 J/cm2、120 J/cm2、240 J/cm2各組平均菌落數(shù)（個(gè)）分別為（555.33±46.44、16.73±0.58、0.33±0.58），與Con相比（1115.67±97.21），差異顯著（P均<0.01），殺菌效果隨能量增加而大幅增加，12 J/cm2組與Con組相比，無(wú)顯著差異（1088.67±137.09，P>0.05）。
　　3.殺菌率的變化：通過(guò)ImageJ軟件分別對(duì)活菌及死菌進(jìn)行定量計(jì)

14、數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，12J/cm2組與Con組相比，無(wú)顯著差異（Con組平均殺菌率0.71%±0.14，12J/cm2組平均殺菌率0.72%±0.11），自60J/cm2開(kāi)始，隨著照射能量的增加，存活的細(xì)菌數(shù)越來(lái)越少；殺菌效果隨能量增加而大幅增加，60J/cm2組的平均殺菌率為52.83%±2.16，至240J/cm2組的平均殺菌率已達(dá)97.10%±1.54。
　　4.藍(lán)光照射后生物膜內(nèi)鮑曼不動(dòng)桿菌的變化：經(jīng)不同能量密度（120 J/cm

15、2，240 J/cm2和360 J/cm2）藍(lán)光照射后，生物膜內(nèi)鮑曼不動(dòng)桿菌被不同程度的殺滅（殺菌率分別為53.3%±5.56、93.67%±2.21、97.14%±1.84），且隨著能量密度的增加，殺菌效果增強(qiáng)；至能量密度360 J/cm2時(shí)，絕大部分鮑曼不動(dòng)桿菌被殺滅（97.14%±1.84）。同樣，電鏡結(jié)果提示，藍(lán)光在殺滅生物膜內(nèi)鮑曼不動(dòng)桿菌的同時(shí)，也破壞了細(xì)菌生物膜的形成，主要表現(xiàn)在生物膜模型結(jié)構(gòu)的破壞及膜內(nèi)菌體結(jié)構(gòu)的破壞。