內(nèi)源性抗菌肽Cathelicidins在慢性阻塞性肺疾病病理改變中作用的研究.pdf

1、研究背景
　　慢性阻塞性肺疾病(Chronicobstructivepulmonarydisease，COPD)是嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)病和多發(fā)病，因其患病率和死亡率高，造成沉重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，已成為全球重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。COPD是一種以氣流受限為特征的慢性氣道炎癥性疾病，小氣道重塑和肺氣腫是引起氣流受限的主要原因，探討其形成機(jī)制，對(duì)于有效控制COPD病情進(jìn)展，具有重要的意義。
　　抗菌肽（antimicrobialpep

2、tides，AMPs）是在動(dòng)物防御系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的一種多肽，由宿主基因編碼，在天然免疫中發(fā)揮重要作用。AMPs主要分為兩大家族:Cathelicidins家族和防御素家族。hCAP18/LL-37（以下簡(jiǎn)稱LL-37）是人體Cathelicidins家族的唯一成員，既往的研究多集中于其抗菌作用，近年來(lái)的研究表明，LL-37在炎癥反應(yīng)、損傷修復(fù)、細(xì)胞增殖和凋亡等多種病理生理過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。
　　我們的前期研究顯示，COPD穩(wěn)定期患

3、者誘導(dǎo)痰中LL-37的表達(dá)較非COPD對(duì)照組顯著增高，且LL-37的表達(dá)與誘導(dǎo)痰中炎癥指標(biāo)IL-8水平呈顯著正相關(guān)，與患者第一秒用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值百分比(FEV1％)呈顯著負(fù)相關(guān);進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者肺組織LL-37的表達(dá)顯著高于非COPD對(duì)照組，LL-37主要表達(dá)于小氣道上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、炎性細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞）和成纖維細(xì)胞中。這些研究結(jié)果表明，異常高表達(dá)的LL-37可能參與了COPD的病理過(guò)程。

4、r>　　分析我們的前期研究結(jié)果可見(jiàn)，LL-37在COPD吸煙組患者肺組織小氣道上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于吸煙對(duì)照組，而不吸煙對(duì)照組患者小氣道上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞中LL-37的表達(dá)顯著低于前兩者?；谏鲜鲅芯勘尘?，我們提出以下問(wèn)題:①COPD患者肺組織小氣道和肺泡上皮細(xì)胞異常高表達(dá)的LL-37是否與小氣道重塑和肺氣腫的病理改變有關(guān)？②吸煙是否為誘導(dǎo)肺組織LL-37表達(dá)增高的重要因素？③COPD小氣道上皮細(xì)胞高表達(dá)的LL-37

5、怎樣影響其周圍的膠原沉積和組織重塑？④LL-37在小氣道區(qū)和肺泡區(qū)均高表達(dá)，但卻出現(xiàn)膠原過(guò)度沉積的小氣道重塑和極少膠原沉積的肺氣腫兩種不同的病理改變，其原因是什么？
　　為了回答上述問(wèn)題，我們進(jìn)行了本課題的設(shè)計(jì)和研究。
　　目的
　　探討內(nèi)源性抗菌肽Cathelicidins在COPD小氣道重塑和肺氣腫病理改變中的作用及相關(guān)機(jī)制。
　　方法
　　1.觀察COPD患者肺組織Cathelicidin(LL-37

6、)的表達(dá)，分析其與COPD小氣道重塑和肺氣腫病理改變的關(guān)系。
　　(1)研究對(duì)象及臨床資料收集:
　　選擇因肺外周腫瘤行肺葉切除術(shù)的患者60例，其中穩(wěn)定期COPD吸煙患者（COPD吸煙組）18例，肺功能正常的吸煙患者（吸煙對(duì)照組）22例，肺功能正常的不吸煙患者（不吸煙對(duì)照組）20例。術(shù)前收集性別、年齡和吸煙史等一般資料，并行肺功能檢查，COPD的診斷按照慢性阻塞性肺疾病全球倡議(GlobalInitiativeforChro

7、nicObstructiveLungDisease,GOLD)標(biāo)準(zhǔn)。
　　(2)人體肺組織標(biāo)本:
　?、貶E染色測(cè)量小氣道壁厚度、平均內(nèi)襯間隔(meanlinearintercept,MLI)和平均肺泡數(shù)(meanalveolarnumber,MAN)，天狼猩紅染色檢測(cè)肺組織膠原沉積面積;
　?、诿庖呓M織化學(xué)染色法檢測(cè)肺組織中LL-37的表達(dá);
　?、鄯治鲂獾绤^(qū)LL-37的表達(dá)與小氣道壁厚度、膠原沉積面積的相關(guān)

8、性，以及肺泡上皮細(xì)胞LL-37的表達(dá)與MLI、MAN的相關(guān)性。
　　2.煙熏法建立大鼠COPD模型，研究香煙煙氣對(duì)大鼠肺組織Cathelicidin(rCRAMP)表達(dá)的影響，并分析Cathelicidin(rCRAMP)與大鼠小氣道重塑和肺氣腫病理改變的關(guān)系。
　　雄性Wistar大鼠72只，隨機(jī)分為煙熏組和空白對(duì)照組，每組根據(jù)造模時(shí)間分為1月組、3月組和6月組，每組各12只。煙熏組大鼠每日置于煙氣染毒柜中被動(dòng)吸煙（南方牌

9、香煙，焦油量:14mg，煙氣煙堿量:1mg）兩次，每次10支香煙持續(xù)30min，兩次間隔時(shí)間不低于6小時(shí)?？瞻讓?duì)照組大鼠不做特殊處理。造模過(guò)程中每隔2周對(duì)大鼠逐只稱重，記錄大鼠體重變化。各組大鼠造模結(jié)束后，對(duì)以下指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè):
　　(1)小動(dòng)物肺功能儀檢測(cè)氣道阻力(RL)、肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性(Cdyn)和潮氣量(VT);
　　(2)HE染色形態(tài)學(xué)測(cè)量小氣道壁厚度、MLI和MAN，天狼猩紅染色檢測(cè)小氣道區(qū)膠原沉積面積;
　　(

10、3)免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)各組大鼠肺組織rCRAMP的表達(dá);
　　(4)分析大鼠肺組織小氣道區(qū)rCRMP的表達(dá)與小氣道壁厚度、膠原沉積的相關(guān)性，以及肺泡上皮細(xì)胞rCRAMP的表達(dá)與MLI、MAN的相關(guān)性。
　　3.建立人支氣管上皮細(xì)胞與肺成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)模型，研究支氣管上皮細(xì)胞分泌的LL-37對(duì)肺成纖維細(xì)胞膠原表達(dá)的影響，并對(duì)其信號(hào)傳導(dǎo)通路進(jìn)行探討。
　　(1)培養(yǎng)人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)，用不同濃度的香煙提取物

11、(CSE)刺激后，免疫熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞中LL-37的表達(dá)。
　　(2)16HBE細(xì)胞與人肺成纖維細(xì)胞(HFL-1)在Transwell六孔板中共培養(yǎng)，給予不同濃度的CSE刺激后，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中LL-37的表達(dá)，Sircol法測(cè)定細(xì)胞上清液中膠原的表達(dá)。
　　(3)HFL-1細(xì)胞在Transwell六孔板下層培養(yǎng)，給予與步驟2相同濃度的CSE刺激后，Sircol法測(cè)定細(xì)胞上清中膠原的表達(dá)。
　　(4)不同

12、濃度的LL-37合成肽、TGF-β1、亂碼LL-37合成肽(sLL-37)刺激HFL-1細(xì)胞48h后，Sircol法檢測(cè)細(xì)胞上清液中膠原的表達(dá)。
　　(5)不同濃度的LL-37合成肽刺激HFL-1細(xì)胞48h后，RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中Ⅰ、Ⅲ型膠原基因的表達(dá)。
　　(6)分別用甲酰肽樣受體（formylpeptidereceptorlike1，F(xiàn)PRL-1）拮抗劑WRW4、ERK阻斷劑PD98059、JNK阻斷劑SP60012

13、5、p38MAPK阻斷劑SB203580、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）阻斷劑LY294002預(yù)處理HFL-1細(xì)胞2h后，再給予LL-37合成肽刺激48h，Sircol法測(cè)定細(xì)胞上清中膠原的表達(dá)。
　　(7)不同濃度的LL-37合成肽刺激HFL-1細(xì)胞不同時(shí)間，Westernblot方法檢測(cè)細(xì)胞裂解物中ERK和磷酸化ERK(pERK)的表達(dá)。
　　(8)分別給予FPRL

14、-1受體拮抗劑WRW4、ERK阻斷劑PD98059預(yù)處理HFL-1細(xì)胞2h后再給予LL-37刺激，Westernblot方法檢測(cè)細(xì)胞裂解物中ERK和pERK的表達(dá)。
　　4.檢測(cè)COPD吸煙組、吸煙對(duì)照組和不吸煙對(duì)照組患者肺組織小氣道區(qū)和肺泡區(qū)成纖維細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白，比較不同區(qū)域成纖維細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)情況，探討COPD患者肺組織成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性。
　　(1)采用免疫組織化學(xué)雙染的方法檢測(cè)肺組織成纖維細(xì)胞波形蛋白(v

15、imentin)、E-鈣粘素(E-cadherin)、CD45的表達(dá)，分析小氣道區(qū)和肺泡區(qū)成纖維細(xì)胞的表型，并計(jì)算每種表型成纖維細(xì)胞所占的比例;
　　(2)用免疫組織化學(xué)染色法對(duì)小氣道區(qū)和肺泡區(qū)成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、彈力蛋白、纖維連接蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果
　　1.(1)COPD吸煙組與肺功能正常的對(duì)照組患者在年齡上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，COPD吸煙組與吸煙對(duì)照組患者吸煙指數(shù)無(wú)顯著差異。COPD吸煙組患者FEV

16、1％與FEV1/FVC均顯著低于肺功能正常的對(duì)照組(P＜0.01，P＜0.01)。
　　(2)與對(duì)照組相比，COPD吸煙組患者小氣道壁厚度顯著增加，MLI顯著增加，MAN顯著降低(P＜0.01)。而上述指標(biāo)在吸煙對(duì)照組和不吸煙對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　(3)COPD吸煙組患者小氣道區(qū)膠原沉積面積較對(duì)照組顯著增多(P＜0.01)，而肺泡區(qū)膠原的表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)。
　　(4)免疫組化染

17、色結(jié)果顯示，LL-37主要表達(dá)于肺組織小氣道上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞（包括中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）和成纖維細(xì)胞。不吸煙對(duì)照組患者肺組織LL-37呈弱陽(yáng)性表達(dá)，COPD吸煙組患者肺組織小氣道區(qū)和肺泡區(qū)LL-37的表達(dá)顯著高于吸煙對(duì)照組(P＜0.01，P＜0.01)，吸煙對(duì)照組患者小氣道區(qū)和肺泡區(qū)LL-37的表達(dá)顯著高于不吸煙對(duì)照組(P＜0.01，P＜0.01)。
　　(5)小氣道上皮細(xì)胞LL-37的平均光密度與小氣道

18、壁厚度和膠原沉積面積顯著正相關(guān)(r=0.62，P＜0.01;r=0.73，P＜0.01);小氣道粘膜下層LL-37陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與小氣道壁厚度和膠原沉積面積顯著正相關(guān)(r=0.65，P＜0.01;r=0.71，P＜0.01);肺泡上皮細(xì)胞LL-37的表達(dá)與MLI顯著正相關(guān)(r=0.64，P＜0.01)，與MAN顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.54，P＜0.01)。
　　2.(1)煙熏大鼠體重增長(zhǎng)較正常大鼠明顯延緩，煙熏6周后大鼠體重與空白對(duì)照組

19、相比差異顯著(P＜0.01)。
　　(2)與空白對(duì)照組相比，煙熏1月組大鼠RL和Cdyn均未出現(xiàn)明顯改變(P＞0.05)，煙熏3月組與煙熏6月組大鼠RL分別增加13.5％和21.9％，Cdyn分別下降18.1％和23.8％。煙熏組大鼠潮氣量與空白對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　(3)煙熏3個(gè)月后，大鼠出現(xiàn)小氣道重塑及肺氣腫的病理改變，表現(xiàn)為小氣道壁增厚，小氣道壁周圍膠原沉積面積增加，肺泡間隔破壞，肺泡腔擴(kuò)大，煙熏

20、6個(gè)月后上述病理改變更加明顯。形態(tài)學(xué)測(cè)量結(jié)果顯示:煙熏3個(gè)月后，大鼠小氣道壁厚度和膠原沉積面積較對(duì)照組顯著增加，且煙熏6月組顯著高于煙熏3月組。煙熏3個(gè)月后大鼠MLI顯著增高，MAN顯著降低。與空白對(duì)照組相比，煙熏6月組大鼠MLI增加70.7％，MAN下降48.9％。煙熏1月組大鼠小氣道壁厚度、膠原沉積面積、MLI和MAN較空白對(duì)照組無(wú)顯著差異（P均＞0.05）。
　　(4)煙熏1個(gè)月后大鼠小氣道區(qū)和肺泡區(qū)rCRAMP的表達(dá)顯著高

21、于空白對(duì)照組，且隨煙熏造模時(shí)間的延長(zhǎng)，rCRAMP的表達(dá)逐漸增加(P＜0.01)。
　　(5)大鼠小氣道區(qū)rCRAMP平均光密度與小氣道壁厚度顯著正相關(guān)(r=0.49，P＜0.01)，與氣道壁周圍膠原沉積面積顯著正相關(guān)(r=0.50，P＜0.01);肺泡上皮細(xì)胞rCRAMP平均光密度與MLI呈顯著正相關(guān)(r=0.45，P＜0.01)，與MAN呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.49，P＜0.01)。
　　3.(1)細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯

22、示CSE刺激后，16HBE細(xì)胞中LL-37的表達(dá)顯著增強(qiáng)。
　　(2)CSE刺激后，16HBE/HFL-1共培養(yǎng)體系中LL-37的濃度增加，膠原的表達(dá)也增加，且LL-37中和抗體顯著降低膠原的表達(dá)(P＜0.05)。
　　(3)CSE刺激后，HFL-1細(xì)胞上清液中膠原的表達(dá)無(wú)明顯改變(P＞0.05)。
　　(4)LL-37合成肽可促進(jìn)HFL-1細(xì)胞膠原的分泌，呈明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系。TGF-β1顯著誘導(dǎo)膠原的產(chǎn)生，其誘導(dǎo)

23、效應(yīng)較LL-37合成肽更強(qiáng)。sLL-37合成肽對(duì)HFL-1細(xì)胞膠原的產(chǎn)生無(wú)明顯影響(P＞0.05)。
　　(5)LL-37合成肽上調(diào)HFL-1細(xì)胞Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA水平，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。
　　(6)FPRL-1拮抗劑WRW4預(yù)處理后，與LL-37合成肽刺激組相比，膠原的分泌顯著下降，且與WRW4呈濃度依賴性。
　　(7)MAPK阻斷劑和PI3K阻斷劑預(yù)處理后，只有ERK阻斷劑PD98059能顯著抑制膠原的分泌

24、(P＜0.05)，其他通路抑制劑對(duì)膠原分泌無(wú)顯著影響(P＞0.05)。
　　(8)LL-37合成肽可誘導(dǎo)ERK磷酸化，在作用30min時(shí)，磷酸化最明顯，且LL-37合成肽對(duì)ERK磷酸化的誘導(dǎo)呈濃度依賴性;WRW4和PD98059可抑制LL-37合成肽誘導(dǎo)的ERK磷酸化。
　　4.(1)在不吸煙對(duì)照組和吸煙對(duì)照組患者的肺組織中只觀察到一種表型的成纖維細(xì)胞(vimentln+CD45-E-cadherin-)，即肺組織來(lái)源的成纖

25、維細(xì)胞;在COPD吸煙組患者的肺組織小氣道區(qū)僅觀察到vimentin+CD45-E-cadherin-表型的成纖維細(xì)胞，而在肺泡區(qū)卻觀察到三種表型的成纖維細(xì)胞:vimentin+E-cadherin+、vimentin+CD45+、vimentin+CD45-E-cadherin-，即上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化來(lái)源、循環(huán)纖維細(xì)胞來(lái)源和肺組織來(lái)源的成纖維細(xì)胞。其中vimentin+E-cadherin+表型的成纖維細(xì)胞約占24.3％，vlmentin+

26、CD45+表型的成纖維細(xì)胞約占12.4％，而大約63.3％的成纖維細(xì)胞來(lái)源于肺組織。
　　(2)與不吸煙對(duì)照組和吸煙對(duì)照組相比，COPD吸煙組患者小氣道區(qū)Ⅰ、Ⅲ型膠原、彈力蛋白、纖維連接蛋白的表達(dá)顯著增高（P均＜0.01），而肺泡區(qū)Ⅰ、Ⅲ型膠原、彈力蛋白、纖維連接蛋白的表達(dá)顯著降低（P均＜0.01）。
　　結(jié)論
　　1.COPD患者肺組織異常增高的Cathelicidin（LL-37）與小氣道重塑和肺氣腫的病理改變顯著

27、相關(guān)。
　　2.香煙煙氣是誘導(dǎo)大鼠肺組織Cathelicidin(rCRAMP)表達(dá)增高的原因，rCRAMP與大鼠小氣道重塑與肺氣腫的病理改變密切相關(guān)。
　　3.CSE誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞分泌的Cathelicidin(LL-37)可通過(guò)結(jié)合上皮下肺成纖維細(xì)胞表面的FPRL-1受體并激活ERK信號(hào)通路促進(jìn)膠原表達(dá)，從而參與小氣道重塑的病理過(guò)程。
　　4.COPD患者肺組織小氣道區(qū)和肺泡區(qū)成纖維細(xì)胞存在明顯的異質(zhì)性;不同區(qū)