臍血嗜堿粒細胞Toll樣受體2在哮喘發(fā)病機制中的作用.pdf

1、第一部分流式細胞術(shù)與免疫磁珠分選法純化臍血嗜堿粒細胞的比較 目的：比較流式細胞術(shù)分選和免疫磁珠分選兩種方法提純臍血嗜堿粒細胞的分選效率。 方法：12份足月產(chǎn)婦新生兒臍血經(jīng)沉淀紅細胞及Ficoll—泛影葡胺處理后，6份用流式細胞術(shù)分選CD203c+ CD45int的細胞，6份用免疫磁珠法分選CD203c+CD117—的細胞。通過特異性識別嗜堿粒細胞的阿利新藍染色和細胞計數(shù)比較兩組臍血嗜堿粒細胞的純度和回收率。 結(jié)果

2、：流式細胞術(shù)分選嗜堿粒細胞所得的純度為95.07±2.94％，高于免疫磁珠分選法84.98±2.84％(P<0.01)；流式細胞術(shù)分選嗜堿粒細胞的回收率為61.42±5.95％，高于免疫磁珠分選法54.17±4.06％(P<0.05)。 結(jié)論：用流式細胞術(shù)分選臍血中CD203c+ CD45int的細胞可獲得高純度、高回收率的嗜堿粒細胞。 第二部分肽聚糖、脂多糖、聚肌胞苷酸對過敏性哮喘患者外周血嗜堿粒細胞釋放介質(zhì)能力的作用

3、 目的：用肽聚糖(PGN)、脂多糖(LPS)、聚肌胞苷酸(Poly I:C)刺激過敏性哮喘患者外周血的嗜堿粒細胞，通過其釋放介質(zhì)能力的作用(即脫顆粒作用)，了解過敏性哮喘患者嗜堿粒細胞上相應的Toll樣受體(TLR)—2、3、4的活性。 方法：分別用不同濃度PGN、LPS、Poly I:C刺激過敏性哮喘患者的外周血單個核細胞(PBMC)，觀察嗜堿粒細胞脫顆粒情況，并與正常人作比較。同時檢測了患者過敏原皮試、特異性IgE和

4、粉塵螨刺激后嗜堿粒細胞的脫顆粒程度，分析經(jīng)TLR途徑的嗜堿粒細胞活化與這三個參數(shù)間的相關(guān)性。 結(jié)果：PGN對過敏性哮喘患者嗜堿粒細胞的脫顆粒作用(40.73％±10.88％)顯著高于LPS(19.63％±8.92％)和Poly I:C(22.5％±7.89％)的作用，也顯著高于正常人(15.23％±8.96％)(P<0.01)。LPS和Poly I:C對過敏性哮喘患者嗜堿粒細胞的脫顆粒程度與正常人無明顯差異(P>0.05)。10

5、0μg/ml PGN是過敏性哮喘患者嗜堿粒細胞脫顆粒實驗的適宜濃度。PGN刺激嗜堿粒細胞脫顆粒指數(shù)與皮試結(jié)果、特異性IgE和粉塵螨刺激脫顆粒指數(shù)無顯著相關(guān)(P>0.05)。 結(jié)論：PGN可增強過敏性哮喘患者外周血嗜堿粒細胞釋放介質(zhì)的能力。由于PGN被公認是TLR2的特異性配體，因此提示在人嗜堿粒細胞存在TLR2，當它被激活后可增強過敏性炎癥。 第三部分觀察肽聚糖對哮喘產(chǎn)婦新生兒臍血嗜堿粒細胞Toll樣受體2的作用

6、 目的：研究PGN對哮喘產(chǎn)婦新生兒臍血嗜堿粒細胞TLR2的作用。 方法：從12例哮喘產(chǎn)婦和23例正常產(chǎn)婦的新生兒臍血中提純嗜堿粒細胞，用PGN刺激，經(jīng)TLR2—FITC熒光抗體標記后，通過流式細胞術(shù)從抗體水平測定臍血嗜堿粒細胞TLR2的表達；以及采用原位雜交技術(shù)從核酸水平觀察臍血嗜堿粒細胞TLR2mRNA的表達。并與不通過TLR2的刺激劑粉塵螨和高滲甘露醇刺激后的結(jié)果作比較。 結(jié)果：流式細胞術(shù)檢測表明：用PGN刺激后，哮

7、喘產(chǎn)婦新生兒臍血嗜堿粒細胞TLR2的表達為45.57±10.92％，顯著高于正常組21.11±9.09％(P<0.01)。原位雜交結(jié)果也顯示：用PGN刺激后，哮喘產(chǎn)婦新生兒臍血嗜堿粒細胞的TLR2mRNA的表達為41.65±14.76％，顯著高于正常組17.73±8.66％(P<0.05)。用粉塵螨和高滲甘露醇刺激正常產(chǎn)婦及哮喘產(chǎn)婦新生兒臍血嗜堿粒細胞，無論從抗體水平(流式細胞術(shù))還是從mRNA水平(原位雜交)檢測，兩組TLR2的表達均

8、無顯著變化(P>0.05)。 結(jié)論：哮喘產(chǎn)婦新生兒臍血嗜堿粒細胞TLR2及TLR2mRNA經(jīng)PGN刺激后表達增高。 第四部分觀察肽聚糖、粉塵螨和高滲甘露醇刺激哮喘產(chǎn)婦新生兒臍血嗜堿粒細胞后白介素-4的釋放 目的：研究PGN、粉塵螨和高滲甘露醇刺激對哮喘產(chǎn)婦臍血嗜堿粒細胞分泌IL-4的作用。 方法：從12例哮喘產(chǎn)婦和23例正常產(chǎn)婦新生兒臍血中純化嗜堿粒細胞，分別經(jīng)PGN、粉塵螨和高滲甘露醇刺激并培養(yǎng)，并以加

9、入緩沖液作為對照，用ELISA法檢測培養(yǎng)的上清液中IL—4的含量。 結(jié)果：PGN、粉塵螨和高滲甘露醇刺激哮喘產(chǎn)婦新生兒臍血嗜堿粒細胞后，其上清液中IL-4的含量均升高，分別為3.22±1.03pg/ml、2.96±0.94 pg/ml、3.46±1.17pg/ml，明顯高于對照組1.52±0.78pg/ml(P<0.01)；而正常組IL-4的含量無顯著變化(P>0.05)。 結(jié)論：PGN、粉塵螨及甘露醇刺激哮喘產(chǎn)婦新生兒

10、臍血嗜堿粒細胞后，均可使之激活并釋放IL—4。 第五部分比較兩種方法純化的臍血嗜堿粒細胞的功能 目的：比較用流式細胞術(shù)或用免疫磁珠法分選獲得的臍血嗜堿粒細胞的功能。 方法：12例哮喘產(chǎn)婦和23例正常產(chǎn)婦新生兒臍血，用流式細胞術(shù)分選CD203c+CD45int的方法或用免疫磁珠法分選CD203c+CD117-的方法獲得臍血嗜堿粒細胞。測定TLR2配體—PGN、過敏原—粉塵螨浸液、高滲甘露醇刺激后，經(jīng)TLR2-FIT

11、C熒光抗體標記后，通過流式細胞術(shù)從抗體水平測定臍血嗜堿粒細胞TLR2的表達，并采用原位雜交技術(shù)從核酸水平觀察臍血嗜堿粒細胞TLR2mRNA的表達，以及用ELISA法檢測培養(yǎng)的上清液中IL—4的含量，比較用兩種方法純化的臍血嗜堿粒細胞的功能。 結(jié)果：流式分選法所得臍血嗜堿粒細胞純度及回收率高于磁珠分選法(P<0.01)。用PGN刺激哮喘產(chǎn)婦新生兒臍血嗜堿粒細胞，其TLR2及TLR2mRNA表達顯著增加(P<0.01)；而正常組無顯

12、著變化(P>0.05)。用粉塵螨及高滲甘露醇刺激正常及哮喘產(chǎn)婦新生兒臍血嗜堿粒細胞，其TLR2及TLR2mRNA的表達無顯著變化(P>0.05)。PGN、粉塵螨和高滲甘露醇刺激哮喘產(chǎn)婦新生兒臍血嗜堿粒細胞，其培養(yǎng)上清液中IL—4的含量均顯著增加(P<0.05)；正常組無顯著變化(P>0.05)。兩種分選方法所得臍血嗜堿粒細胞TLR2的表達、TLR2mRNA的表達以及培養(yǎng)上清液中IL—4的含量無顯著差異(P>0.05)。 結(jié)論：用