人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞Toll樣受體的表達(dá)以及Toll樣受體2功能的初步研究.pdf

1、Toll樣受體(TLR)是近年來發(fā)現(xiàn)的一組新的模式識別受體，在天然免疫和獲得性免疫中均有重要作用。皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)是機(jī)體與外界環(huán)境接觸的首要屏障細(xì)胞，易受各種微生物的侵襲，TLR在其中發(fā)揮重要作用。TLR在很多炎癥性和感染性皮膚病中有一定作用。到目前為止，KC中TLR的表達(dá)仍未明確，KC的TLR調(diào)節(jié)和功能的研究不多。本課題擬檢測KC的TLR表達(dá)譜，研究金黃色葡萄球菌肽聚糖(PGN)對KC部分TLR表達(dá)的影響，以及對KC分泌趨化因

2、子的影響及TLR在其中的作用，為今后研究TLR在某些感染性和炎癥性皮膚病中作用奠定基礎(chǔ)。全文共分三部分。 第一部分人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞Toll樣受體表達(dá)的研究目的研究人表皮KC中TLR的表達(dá)譜。方法：培養(yǎng)人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT細(xì)胞和正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(NHEK)以及用分散酶分離表皮，分別用RT-PCR檢測10種TLRmRNA表達(dá)。流式細(xì)胞儀檢測HaCaT細(xì)胞和NHEK表面TLR2和TLR4蛋白的表達(dá)。結(jié)果：HaCaT

3、細(xì)胞、NHEK以及分離的表皮均有全部10種TJRmRNA表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)弱各不相同。流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示HaCaT細(xì)胞和NHEK表面均有TLR4蛋白的表達(dá)，而TLR2無明顯表達(dá)。結(jié)論：人表皮KC有TLR1～10mRNA的組成性表達(dá)，細(xì)胞表面有TLR4蛋白的表達(dá)。 第二部分金黃色葡萄球菌肽聚糖對HaCaT細(xì)胞Toll樣受體2和4表達(dá)的影響目的研究病原體成分對HaCaT細(xì)胞TLR2和TLR4表達(dá)的調(diào)節(jié)。方法：不同濃度的金黃色葡萄球菌胞壁

4、成分PGN與HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)不同時間后，RT-PCR法檢測TLR2和TLR4mRNA表達(dá)變化。流式細(xì)胞術(shù)檢測HaCaT細(xì)胞表面TUR2和TLR4蛋白的表達(dá)。結(jié)果：與30μg/ml PGN共培養(yǎng)6小時后，HaCaT細(xì)胞TLR2和TLR4mRNA表達(dá)明顯升高。與100μg/ml PGN共培養(yǎng)24小時后，HaCaT細(xì)胞表面TLR2和TLR4蛋白表達(dá)量最高。結(jié)論：PGN可以上調(diào)HaCaT細(xì)胞TLR2和TLR4的表達(dá)。 第三部分金黃色

5、葡萄球菌肽聚糖對正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞分泌趨化因子的影響及Toll樣受體2的作用目的研究金黃色葡萄球菌PGN對NHEK分泌白介素-8(IL-8)、調(diào)節(jié)激活和正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的細(xì)胞因子(RANTES)以及巨噬細(xì)胞來源的趨化因子(MDC)的影響以及TLR2在其中的作用。方法：不同濃度的金黃色葡萄球菌PGN與NHEK共培養(yǎng)不同時間后，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法(ELISA)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-8、RANTES以及MDC的濃度。預(yù)先加用功

6、能性TLR2單克隆抗體處理培養(yǎng)細(xì)胞，再以100μg/ml PGN與NHEK共培養(yǎng)12小時，檢測上述趨化因子的濃度。結(jié)果：NHEK可以自發(fā)的分泌IL-8和RANTES。隨共培養(yǎng)的PGN濃度的升高，培養(yǎng)時間的延長，IL-8分泌量逐漸增多，RANTES分泌量逐漸降低。TLR2單克隆抗體可以明顯抑制PGN誘導(dǎo)的IL-8分泌，對RANTES分泌量無明顯影響。未檢測到NHEK自發(fā)或PGN刺激作用下產(chǎn)生MDC。結(jié)論：PGN很可能通過激活TLR2途徑誘