卡介苗對(duì)人THP-1細(xì)胞TOLL樣受體2表達(dá)水平影響的機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis，Mtb)感染引起的慢性傳染病，其發(fā)病率和死亡率均居重大傳染病前列，嚴(yán)重威脅人類的健康和生命。據(jù)世界衛(wèi)生組織2012年全球結(jié)核病報(bào)告:2011年全球估計(jì)有870萬(wàn)新發(fā)結(jié)核病例。我國(guó)是世界上22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，現(xiàn)有結(jié)核病患者約500萬(wàn)人，僅次于印度居世界第二位。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，控制結(jié)核的新發(fā)病例數(shù)仍是當(dāng)前重要的工作之一。Mtb是典型的胞內(nèi)寄生菌，在感染早期主要寄生在肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)，

2、感染晚期主要寄生在肺巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞內(nèi)。因此，體內(nèi)的單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)既是抵抗Mtb感染的第一道防線，也是最關(guān)鍵的一道防線。Mtb被巨噬細(xì)胞的吞噬過(guò)程主要由Toll樣受體(TLRs)介導(dǎo)。故研究早期天然免疫中TLRs與Mtb之間的關(guān)系，有利于了解機(jī)體在結(jié)核感染最初的免疫反應(yīng)。
　　 TLRs是一群主要分布在單核-巨噬細(xì)胞膜表面的跨膜蛋白受體，能識(shí)別細(xì)菌、病毒等多種病原體，也是巨噬細(xì)胞最早接觸Mtb的抗原遞呈分子，TLRs的活

3、化程度在細(xì)胞吞噬病原微生物及隨后的免疫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。迄今為止，人類已發(fā)現(xiàn)11個(gè)Toll樣受體家族成員(TLR1-11)，其中TLR2及其信號(hào)通路在抗結(jié)核免疫中起著關(guān)鍵作用。現(xiàn)已證實(shí)TLR2可以由多種結(jié)核胞壁蛋白、菌體等激活，將Mtb感染的信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)使髓樣分化蛋白88(MyD88)活化，核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)激活，釋放炎癥因子IL-6、IL-10、TNF-α、和IFN-γ，參與機(jī)體早期免疫反應(yīng)。同時(shí)誘導(dǎo)

4、未接觸抗原的T細(xì)胞活化，并產(chǎn)生共同刺激分子B7.1，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)機(jī)體的特異性免疫應(yīng)答。因此TLR2及其信號(hào)通路被認(rèn)為是機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)結(jié)核分枝桿菌非特異性和特異性免疫應(yīng)答的重要途徑。因?yàn)門LR2與結(jié)核桿菌感染的關(guān)系密切，近年來(lái)，有諸多學(xué)者致力于研究TLR2的結(jié)構(gòu)、表達(dá)與功能之間的聯(lián)系，以明確TLR2從相應(yīng)受體到功能的意義。眾多的實(shí)驗(yàn)表明，無(wú)論是在體外Mtb感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)還是分離結(jié)核病人外周血，TLR2基因mRNA表達(dá)水平均上調(diào)，但這種上調(diào)的

5、機(jī)制以及TLR2基因本身的上游調(diào)控因子仍不十分清楚。
　　 目前已有的研究報(bào)道顯示，鳥結(jié)核分枝桿菌感染小鼠的巨噬細(xì)胞后，TLR2表達(dá)上調(diào)，并且這種上調(diào)作用受到TLR2基因啟動(dòng)子上游的NF-κB和Sp1反應(yīng)元件共同介導(dǎo)。但是人類TLR2基因與小鼠的TLR2基因結(jié)構(gòu)有很大不同，上游啟動(dòng)子序列也不盡相同。因此，鑒定人類TLR2基因啟動(dòng)子上游的具有功能性的反應(yīng)元件，并且闡明其在結(jié)核桿菌感染中的作用機(jī)制至關(guān)重要。
　　 本研究以卡

6、介苗(BCG)，一種減毒結(jié)核桿菌為刺激因素，探討B(tài)CG對(duì)TLR2基因表達(dá)的影響及其作用機(jī)制。通過(guò)分析TLR2基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)，我們鑒定了TLR2啟動(dòng)子區(qū)的一個(gè)AP-2a反應(yīng)元件，并證明了BCG感染通過(guò)增加AP-2a的表達(dá)，從而使更多的AP-2a蛋白參與到AP-2a位點(diǎn)的蛋白質(zhì)復(fù)合物中，改變其DNA親和力來(lái)調(diào)節(jié)TLR2啟動(dòng)子活性，從而調(diào)控TLR2mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。本研究的發(fā)現(xiàn)不僅對(duì)深入了解TLR2基因功能有重要意義，而且將為闡明結(jié)核病

7、的發(fā)病機(jī)制，預(yù)防和綜合控制結(jié)核病的傳播提供新思路。
　　 材料與方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 1、人淋巴瘤白血病單核細(xì)胞系THP-1;
　　 2、刺激藥物:氟波酯PMA;
　　 3、RNA提取相關(guān)試劑、RT試劑盒及Real-time PCR相關(guān)試劑;;
　　 4、基因重組及螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)相關(guān)試劑及試劑盒;
　　 5、電泳泳動(dòng)遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)及染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）

8、相關(guān)試劑;
　　 6、Western blot相關(guān)試劑。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1、Real-time PCR檢測(cè)BCG感染前后TLR2 mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化;
　　 2、利用生物信息學(xué)軟件分析TLR2基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)，構(gòu)建TLR2啟動(dòng)子序列系列截短的螢光素酶報(bào)告基因重組體，應(yīng)用雙熒光素酶活性檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)啟動(dòng)子的活性，鑒定TLR2基因啟動(dòng)子關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū);
　　 3、EMSA方法體外

9、鑒定TLR2基因啟動(dòng)子內(nèi)activator protein-2 alpha(AP-2α)反應(yīng)元件;ChIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步在體內(nèi)條件下驗(yàn)證AP-2α與該位點(diǎn)的結(jié)合。
　　 4、應(yīng)用雙熒光素酶活性檢測(cè)RNA干涉敲減AP-2α轉(zhuǎn)錄因子對(duì)TLR2啟動(dòng)子活性的影響;
　　 5、Real time RT-PCR檢測(cè)BCG感染對(duì)RNA干涉敲減AP-2α后TLR2mRNA表達(dá)水平的影響。
　　 6、應(yīng)用雙熒光素酶活性檢測(cè)BCG感染對(duì)

10、RNA干涉敲減AP-2α后TLR2啟動(dòng)子活性的影響;
　　 7、Western blot檢測(cè)BCG感染對(duì)轉(zhuǎn)錄因子AP-2α蛋白表達(dá)水平的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、Real-time PCR結(jié)果表明BCG感染上調(diào)TLR2 mRNA的表達(dá)水平;Western印跡雜交顯示THP-1細(xì)胞中TLR2蛋白在BCG感染后上調(diào);
　　 2、ALiBaba2.1和TRANSFAC TESS軟件預(yù)測(cè)及熒光素酶報(bào)告基因分

11、析結(jié)果顯示TLR2啟動(dòng)子區(qū)-190～-140區(qū)域是該基因關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū);
　　 3、EMSA實(shí)驗(yàn)在體外條件下證明了TLR2啟動(dòng)子-184～-172區(qū)存在AP-2α反應(yīng)元件;CHIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步在體內(nèi)條件下獲得了相同的結(jié)果;
　　 4、熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示抑制內(nèi)源性AP-2α表達(dá)降低了細(xì)胞TLR2基因啟動(dòng)子活性;
　　 5、Real-time PCR結(jié)果表明在BCG感染條件下，RNAi敲減AP-2α，TLR

12、2基因mRNA表達(dá)降低;
　　 6、熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示在BCG感染條件下，RNAi敲減AP-2α，TLR2基因啟動(dòng)子活性降低;
　　 7、Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示BCG感染可上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子AP-2α蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1、BCG感染可以上調(diào)TLR2基因mRNA和蛋白表達(dá)水平;
　　 2、TLR2基因啟動(dòng)子184～-172區(qū)域存在AP-2a反應(yīng)元件;
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