激活NLRP3與NOD2受體對(duì)THP-1炎癥因子表達(dá)的影響.pdf

1、目的:
　　 具有核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)的NOD樣受體(NOD-LikeReceptors，NLRs)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的一種重要的模式識(shí)別受體（PatternRecognitionreceptors，PRRs）。NLRs是一組具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的胞質(zhì)蛋白，廣泛參與機(jī)體的炎癥應(yīng)答反應(yīng)。NLRs家族包括5類成員，NODs、NALPs、ICE、CIITA、IPAF/NAIP。NLRP3和NOD2是NLRs的兩個(gè)重要成員，在炎癥

2、反應(yīng)中起著關(guān)鍵的作用。ATP是NLRP3的特異性配體，當(dāng)ATP刺激嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞后可以引起NLRP3表達(dá)增強(qiáng)，活化后的NLRP3可導(dǎo)致半胱天冬酶(caspase-1)的自身激活，最后切割炎癥前體并引起IL-1β和IL-18分泌增多并排至胞外[1]。MDP是NOD2的特異性配體，MDP刺激單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞后可以引起NOD2活化，啟動(dòng)經(jīng)典NF-κB信號(hào)途徑，使無活性炎癥前體基因轉(zhuǎn)錄顯著增加，也可以通過NLRP1途徑激活caspas

3、e-1，這將為無活性炎癥前體的活化提供了一個(gè)反應(yīng)平臺(tái)。目前關(guān)于激活NLRP3與NOD2受體對(duì)THP-1炎癥因子表達(dá)影響的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過胞內(nèi)識(shí)別受體的特異性配體MDP、ATP單獨(dú)與聯(lián)合刺激人單核細(xì)胞株(THP-1)，觀察細(xì)胞為NLRP3炎癥小體、caspase-1的mRNA表達(dá)情況及細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-18炎癥因子表達(dá)的變化，探討激活NLRP3與NOD2受體對(duì)THP-1炎癥因子表達(dá)的影響。
　　 方法:
　　

4、 選取購自中科院上海生命科學(xué)研究院人單核細(xì)胞株(THP-1)進(jìn)行藥物干預(yù)試驗(yàn)。將4瓶狀態(tài)良好的THP-1經(jīng)過細(xì)胞計(jì)數(shù)后各瓶均加入培養(yǎng)液至10ml。選定MDP藥物濃度為0.5μM，ATP藥物濃度為100μM，經(jīng)過物質(zhì)的量計(jì)算后10ml液體應(yīng)加入所需藥物25μl，ATP256μl。實(shí)驗(yàn)分為4組:空白對(duì)照組（加入PBS100μl后放入37℃CO2孵箱恒溫孵育24h）;TMDP組（加入藥物濃度為0.5μM的MDP25μl，放入37℃CO2孵箱

5、恒溫孵育24h）;TATP組（加入藥物濃度為100μM的ATP256μl，放入37℃CO2孵箱恒溫孵育24h）;TMDP+ATP組（加入藥物濃度為0.5μM的MDP25μl預(yù)刺激后放入37℃CO2孵箱恒溫孵育2h，然后再加入藥物濃度為100μM的ATP256μl，放入37℃CO2孵箱恒溫孵育24h）。恒溫孵育后，將以上細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15ml離心管。恒溫下離心7分鐘（1500rpm/min）后溶液分為上清液及沉淀層，取上清液200μl行酶聯(lián)免

6、疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定IL-1β及IL-18的表達(dá)，余上清用槍頭吸凈棄之，剩余細(xì)胞沉淀用來提取RNA行realtime-PCR測定NLRP3、caspase-1的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1、應(yīng)用MDP及ATP單獨(dú)刺激THP-1與兩者聯(lián)合刺激THP-1相比較，單核細(xì)胞上清液中IL-1β及IL-18的表達(dá)為:TATP組和TMDP組與空白組比較均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，TMDP+ATP組與空白組、

7、TMDP、TATP組比較有明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 2、應(yīng)用MDP及ATP單獨(dú)刺激THP-1與兩者聯(lián)合刺激THP-1相比較，單核細(xì)胞中NLRP3mRNA的表達(dá)為:TATP組與空白組比較略升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，TMDP+TATP組與空白組、TMDP、TATP組比較明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 3、應(yīng)用MDP及ATP單獨(dú)刺激THP-1與兩者聯(lián)合刺激THP-1相

8、比較，單核細(xì)胞中caspase-1mRNA的表達(dá)為:TMDP組和TATP組與空白組比較均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，TMDP+TATP組與空白組、TMDP、TATP組比較有明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、NOD2的特異性配體MDP單獨(dú)刺激THP-1后NLRP3無表達(dá)，下游炎癥因子caspase-1及IL-1β、IL-18較弱表達(dá)。
　　 2、NOD2的特異性配體M