活性氧激活NLRP3炎癥小體啟動(dòng)干眼炎癥反應(yīng)的機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 活性氧激活的NLRP3炎癥小體在小鼠干眼發(fā)病中的機(jī)制研究
　　目的:研究活性氧(ROS)在小鼠環(huán)境誘導(dǎo)型干眼發(fā)病過(guò)程中的作用，并確定ROS是否通過(guò)激活NLRP3炎癥小體來(lái)介導(dǎo)干眼炎癥反應(yīng)。
　　方法:研究采用本課題組開(kāi)發(fā)的智能控制環(huán)境系統(tǒng)(ICES)創(chuàng)建小鼠干眼模型，在這個(gè)系統(tǒng)中相對(duì)濕度、空氣流速和溫度分別維持在15.3±3％，2.1±0.2m/s和21-23℃。將C57

2、BL/6系雌性小鼠（4-6周齡）置于ICES系統(tǒng)中1周、2周以誘導(dǎo)干眼，并予配置的0.3％ N-acetyl-L-cysteine(NAC，ROS抑制劑)眼水局部點(diǎn)眼，觀察其對(duì)干眼形成的抑制效果。實(shí)驗(yàn)分為5組:1）置于正常環(huán)境并無(wú)干預(yù)措施的正常對(duì)照組;2）置于ICES中1周組;3）置于ICES中2周組;4）置于ICES中并同時(shí)雙眼予0.3％ NAC眼水點(diǎn)眼2周組;5）置于ICES中并同時(shí)雙眼予生理鹽水(NS)點(diǎn)眼2周組。在實(shí)驗(yàn)第0、1、

3、2周進(jìn)行所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的臨床眼表評(píng)估（角膜熒光染色評(píng)分），后分別取各組小鼠角膜、結(jié)膜組織或完整眼球。ROS試劑盒檢測(cè)組織中ROS水平，應(yīng)用Real Time-PCR、免疫熒光共聚焦顯微鏡、ELISA等方法檢測(cè)評(píng)估角膜、結(jié)膜組織中NLRP3、Caspase-1、ASC、和IL-1β表達(dá)情況，并用熒光試劑盒檢測(cè)Caspase-1的活性程度。
　　結(jié)果:小鼠角膜熒光素鈉染色評(píng)分隨ICES時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，ICES1周時(shí)點(diǎn)染有少量增加，但I(xiàn)

4、CES2周點(diǎn)染顯著多于正常對(duì)照組和ICES1周組。ROS在小鼠角膜、結(jié)膜中的表達(dá)在ICES1周開(kāi)始即有明顯的持續(xù)性增多。Real Time-PCR結(jié)果示角膜、結(jié)膜組織NLRP3、Caspase-1、ASC、和IL-1β的基因表達(dá)在ICES1周時(shí)與正常對(duì)照組無(wú)差異，但在ICES2周時(shí)表達(dá)顯著升高;免疫熒光共聚焦顯微鏡半定量檢測(cè)NLRP3、Caspase-1、和IL-1β的蛋白表達(dá)水平與基因表達(dá)情況一致。Caspase-1活性在ICES1周

5、時(shí)與正常對(duì)照組無(wú)差異，但I(xiàn)CES2周時(shí)明顯增強(qiáng)。ROS抑制劑NAC眼水點(diǎn)眼2周后小鼠角膜熒光素鈉染色顯著下降，接近正常水平;其角膜、結(jié)膜中的ROS表達(dá)也明顯降低，同時(shí)NLRP3、Caspase-1、ASC、和IL-1β的基因和蛋白表達(dá)量及Caspase-1的活性，均明顯低于NS對(duì)照組。
　　結(jié)論:ROS的過(guò)表達(dá)參與環(huán)境誘導(dǎo)性干眼的發(fā)病，其通過(guò)激活NLRP3炎癥小體從而介導(dǎo)干眼炎癥介質(zhì)IL-1β的過(guò)表達(dá)。ROS-NLRP3-IL-1

6、β這一事件軸的激活可能是環(huán)境誘導(dǎo)性干眼的啟動(dòng)程序。
　　第二部分 高滲刺激的人角膜上皮細(xì)胞NLRP3炎癥小體作用的機(jī)制研究
　　目的:以高滲刺激下的人角膜上皮細(xì)胞株(HCECs)為對(duì)象，研究ROS、胞內(nèi)受體NLRP3及炎癥因子IL-1β在RO S-NLRP3-IL-1β信號(hào)通路中的各自地位和作用。
　　方法:首先檢測(cè)不同程度高滲透壓刺激后HCECs中ROS及NLRP3炎癥小體各聚合成分（NLRP3、ASC和Caspas

7、e-1）和IL-1β的mRNA的相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢(shì)，并選擇出最佳高滲透壓進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。第二，以310 mOsm為等滲對(duì)照組、500 mOsm為高滲對(duì)照組，比較予ROS抑制劑NAC20mM預(yù)處理的HCECs對(duì)500 mOsm高滲刺激的反應(yīng)。用ROS探針氯甲基二氯二氫熒光素二乙酯檢測(cè)細(xì)胞中ROS水平，Real-time PCR檢測(cè)NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的基因表達(dá)量，Western blot檢測(cè)NLRP3的蛋白表

8、達(dá)，并分別用熒光試劑盒和ELISA定量檢測(cè)細(xì)胞中Caspase-1的活性程度和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中活性IL-1β的含量。第三，設(shè)計(jì)合成靶向人NLRP3的干擾RNA，轉(zhuǎn)染至HCECs后再予500 mOsm高滲刺激，設(shè)等滲、高滲對(duì)照組和陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照組，同樣方法檢測(cè)細(xì)胞中NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的基因表達(dá)、NLRP3的蛋白表達(dá)，及Caspase-1的活性程度和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中活性IL-1β的含量。
　　結(jié)果:HCE

9、Cs中ROS水平及NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的mRNA表達(dá)在高滲透壓到一定程度后（500 mOsm以上）才出現(xiàn)明顯的升高，500 mOsm對(duì)本細(xì)胞株是較佳的刺激程度。NAC預(yù)處理的HCECs對(duì)500 mOsm高滲刺激反應(yīng)下調(diào)，與高滲對(duì)照組相比，其細(xì)胞內(nèi)ROS被基本清除，NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的mRNA表達(dá)下降，同時(shí)NLRP3的蛋白表達(dá)也降低，Caspase-1活性減弱，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中

10、活性IL-1β的含量下降。成功轉(zhuǎn)染NLRP3干擾RNA后的HCECs中NLRP3基因表達(dá)被抑制，對(duì)500 mOsm高滲刺激無(wú)明顯反應(yīng)，與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組相比，其NLRP3炎癥小體各成分的mRNA表達(dá)降低，Caspase-1活性減弱，分泌的活性IL-1β也減少。
　　結(jié)論:高滲刺激的HCECs，首先使ROS的生成迅速增多，ROS再激活NLRP3炎癥小體使其分泌過(guò)量的活性IL-1β，這個(gè)過(guò)程中ROS、NLRP3和IL-1β存在有序性信號(hào)

11、傳導(dǎo)，提示RO S-NLRP3-IL-1β信號(hào)通路對(duì)啟動(dòng)干眼炎癥反應(yīng)的重要啟動(dòng)作用。
　　第三部分 ROS-NLRP3-I L-1β信號(hào)通路在外環(huán)境性干眼患者中的初步驗(yàn)證
　　目的:研究臨床外環(huán)境性干眼患者結(jié)膜上皮細(xì)胞和淚液樣本中ROS、模式識(shí)別受體NLRP3及炎癥因子IL-1β相對(duì)于正常人的表達(dá)差異，以驗(yàn)證ROS-NLRP3-1L-1β信號(hào)通路是否參與臨床干眼的發(fā)病過(guò)程。
　　方法:實(shí)驗(yàn)對(duì)象為單純由低濕度、高風(fēng)速環(huán)境

12、，或職業(yè)環(huán)境因素如過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的視頻終端儀器(VDT)的使用引起的臨床外環(huán)境性干眼患者，并且符合眼表自覺(jué)癥狀OSDI(Ocular Surface Disorder Index)評(píng)分＞20分且淚膜破裂時(shí)間(TBUT)＜5s，入選符合標(biāo)準(zhǔn)的干眼患者20例和正常對(duì)照組15例。結(jié)膜印跡細(xì)胞法取結(jié)膜上皮細(xì)胞，高速離心法收集Schirmer試紙中的淚液，用ROS探針二氯二氫熒光素二乙酯檢測(cè)結(jié)膜上皮細(xì)胞中ROS水平，Real-time PCR檢測(cè)其NL

13、RP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的基因表達(dá)量，并用ELISA試劑盒定量檢測(cè)淚液中活性IL-1β的含量。
　　結(jié)果:外環(huán)境性干眼病人組中男性7例，女性13例，年齡為33.5±7.3歲;正常組男性5例，女性10例，年齡為30.3±6.5歲，兩組間性別比及年齡均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。干眼組OSDI分值36.35±10.70，正常組為3.45±2.05，兩組差異顯著(P＜0.001);干眼組TBUT為3.13±1.22s，明顯低于正

14、常組的11.93±1.39s(P＜0.001);SchirmerⅠ試驗(yàn)在干眼組為7.13±3.63mm/5 min，也明顯小于正常組的12.6±2.52mm/5min(P＜0.001)。干眼組結(jié)膜上皮細(xì)胞中ROS水平，NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的mRNA水平及淚液中活性IL-1β的含量都顯著高于正常組(P≤0.023)。且干眼組淚液樣本中的活性IL-1β水平與OSDI分值呈正相關(guān)（R2=0.402，P=0.003