NLRP3炎癥小體在淋巴瘤患者中的表達及相關(guān)功能研究.pdf

1、研究背景:
　　淋巴瘤是源于淋巴造血系統(tǒng)的惡性腫瘤。隨著診療手段的不斷發(fā)展，患者的生存期和生活質(zhì)量得到了很大改善，仍有很大一部分淋巴瘤患者會出現(xiàn)復發(fā)或耐藥，甚至導致死亡。淋巴瘤屬于免疫系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)生是多因素、多環(huán)節(jié)、多基因相互作用的結(jié)果，它與遺傳、免疫微環(huán)境的異常、抑癌基因的失活、細胞凋亡和細胞異常增殖等有關(guān)。最近研究顯示，腫瘤細胞在發(fā)生發(fā)展或被化療藥物殺傷時，均可產(chǎn)生炎癥小體。炎癥小體是參與機體免疫的重要組成部分，NLRP3炎

2、癥小體是目前研究得最清楚的炎癥小體，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和化療耐藥中占據(jù)重要地位。
　　研究目的:
　　研究淋巴瘤患者NLRP3炎癥小體相關(guān)基因的多態(tài)性和表達，并評估其臨床意義，利用淋巴瘤細胞系進行功能試驗進一步探索其功能并闡明其在淋巴瘤中的作用機制。
　　研究方法:
　　1、淋巴瘤患者NLRP3相關(guān)基因SNPs檢測:選取390例淋巴瘤患者和385例健康對照者為研究對象，刮取淋巴瘤患者骨髓涂片，抽取健康對照者EDTA

3、抗凝全血，然后應用DNA樣本提取試劑盒提取DNA，PCR（探針法）檢測IL-18(rs1946518)、IL-1β(rs16944)、CARD8(rs2043211)、NFκB94ins/del(rs28362491)各基因分型。
　　2、淋巴瘤患者及正常對照的NLRP3相關(guān)基因的表達:選取68例淋巴瘤患者(46例新診斷的患者和22例緩解患者)和40例健康對照提取外周血mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，設計引物，應用RT-PCR方法檢測

4、淋巴瘤患者和正常對照者的外周血單個核細胞中IL-18、IL-1β、caspase-1、NLRP3、ASC、NFκB基因mRNA水平的表達。應用ELISA方法檢測淋巴瘤患者和健康對照外周血清中IL-18、IL-1β的水平。免疫組織化學方法檢測淋巴瘤患者淋巴瘤組織病理切片及正常淋巴結(jié)組織切片中NLRP3相關(guān)基因IL-18、NLRP3、ASC的表達。
　　3、在淋巴瘤細胞系Pfeiffe中加入LPS+ATP處理后，應用Western b

5、lot法檢測ASC及NFκB蛋白的表達水平，以GAPDH作內(nèi)參。
　　4、設置地塞米松濃度梯度，觀察NLRP3炎癥小體活化對Pfeiffer細胞藥物敏感性影響。實驗分組設計為對照組、LPS+ATP組、DEX組、DEX+LPS+ATP組，收集各組細胞和上清液進行相關(guān)指標檢測。應用ELISA方法測定各組細胞培養(yǎng)上清液中IL-18和IL-1β的濃度，應用RT-PCR方法檢測各組細胞IL-18、IL-1β、caspase-1、NLRP3、

6、c-myc、TP53、bcl-2、bax基因mRNA水平的表達。
　　5、在Pfeiffer培養(yǎng)體系中加入IL-18和抗IL-18培養(yǎng)48h。實驗分組設計為對照組、DEX組、IL-18+DEX組、抗IL-18+DEX組，收集各組細胞進行相關(guān)指標檢測。應用RT-PCR方法檢測各組細胞c-myc、TP53、bcl-2、bax基因mRNA水平的表達。
　　6、CCK8方法檢測各組細胞增殖情況，并進行藥敏分析;根據(jù)細胞周期試劑盒說明

7、應用流式細胞術(shù)進行細胞周期分析;使用Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒流式細胞術(shù)分析各組細胞凋亡情況。
　　7、統(tǒng)計學分析:將連續(xù)變量和分類變量用方差分析或非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗進行比較。標準卡方檢驗用于測試Hardy-Weinberg平衡的基因型頻率。通過計算優(yōu)勢比(OR)和相應的95％置信區(qū)間(CI)來評估基因型與疾病風險之間的關(guān)聯(lián)。使用Mann-Whitney U檢驗進行RT-PCR和ELISA檢測的各組

8、結(jié)果之間的比較。Kaplan-Meier曲線用于描述存活。進行細胞實驗三次，定量數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差，使用非配對t檢驗進行統(tǒng)計學分析。P＜0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。
　　研究結(jié)果:
　　一、NLRP3炎癥小體相關(guān)基因SNPs與淋巴瘤的易感性及預后的相關(guān)性研究
　　1、炎癥小體NLRP3相關(guān)基因多態(tài)性與淋巴瘤的易感性:淋巴瘤患者IL-18(rs1946518)和NFκ394ins/del(rs28362491)基

9、因型分布與正常對照具有顯著性差異。
　　2、L-18(rs1946518)和NFκB94ins/del(rs28362491)的等位基因與淋巴瘤的易感性:攜帶IL-18(rs1946518)等位基因“G”和NFκB94ins/del(rs28362491)等位基因“ins”者淋巴瘤患病風險均顯著增加。
　　3、NLRP3炎癥小體基因多態(tài)性與淋巴瘤患者臨床指標相關(guān)性:IL-18(rs1946518)基因型與LDH水平相關(guān)，CA

10、RD8(rs2043211)基因型與性別、B癥狀和結(jié)外浸潤部位相關(guān)，NFκB94ins/del(rs28362491)與LDH水平、分型和骨髓浸潤相關(guān)。
　　4、IL-18(rs1946518)和NFκB94ins/del(rs28362491)與B細胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)易感性:IL-18(rs1946518)與T-NHL和B-NHL易感性均具有顯著相關(guān)性。而NFκ394ins/del(rs28362491)僅與B-NH

11、L的易感性顯著相關(guān)。攜帶IL-18等位基因“G”者，T-NHL和B-NHL患病風險均顯著增加。攜帶NF-kB等位基因“ins”者，B-NHL患病風險顯著增加。
　　5、CARD8(rs2043211)的AA基因型及LDH水平較高的淋巴瘤患者具有較短的生存期。
　　二、NLRP3炎癥小體相關(guān)基因在淋巴瘤患者中的表達及相關(guān)功能研究
　　1、NLRP3炎癥小體相關(guān)基因表達:NLRP3相關(guān)基因IL-18、IL-1β、caspa

12、se-1、NLRP3和NFκ3的mRNA表達在淋巴瘤患者中均明顯高于正常人，但治療后緩解淋巴瘤患者中只有IL-18mRNA表達明顯低于新診斷淋巴瘤患者，其它基因表達未見顯著性差異。IL-18(rs1946518)、NFκB94ins/del(rs28362491)、IL-1β(rs16944)基因不同基因型間mRNA表達均無顯著性差異。
　　2、淋巴瘤患者外周血血清IL-18以及IL-1β水平:新診斷的淋巴瘤患者的血清IL-18水

13、平顯著高于對照組，化療緩解后較化療前顯著降低。而新診斷的淋巴瘤患者血清IL-1β水平顯著高于對照組，但化療緩解后與化療前相比沒有顯著變化，IL-18(rs1946518)GT基因型患者的血清IL-18水平顯著高于GG基因型。
　　3、淋巴瘤病理組織中NLRP3相關(guān)基因表達:淋巴瘤患者ASC和NLRP3表達明顯高于正常對照，IL-18表達略高于正常對照。
　　4、NLRP3炎癥小體活化驗證:用LPS刺激6h，ATP作用1h后，

14、Pfeiffer細胞ASC和NFκB的蛋白表達水平升高，NLRP3相關(guān)基因IL-18、caspase-1、IL-1β、NLRP3的mRNA表達均升高，培養(yǎng)上清液中IL-18和IL-1β水平顯著升高，均提示NLRP3炎癥小體被活化。
　　5、NLRP3炎癥小體的活化增強了Pfeiffer細胞對地塞米松的耐藥性:LPS+ATP處理細胞后，地塞米松對Pfeiffer細胞的抑制率下降，顯著提高了地塞米松的IC50值。
　　6、NLR

15、P3炎癥小體減弱地塞米松對細胞增殖的抑制作用:地塞米松可抑制pfeiffer細胞增殖，NLRP3炎癥小體的活化促進細胞周期從G1進入S期，通過上調(diào)c-myc mRNA表達，減弱了地塞米松對細胞周期的影響，從而促進細胞增殖。
　　7、NLRP3炎癥小體抑制地塞米松誘導的細胞凋亡作用:地塞米松可誘導pfeiffer細胞凋亡，NLRP3炎癥小體的活化通過上調(diào)bcl-2和下調(diào)Bax從而抑制細胞凋亡，減弱地塞米松的促凋亡作用。
　　8

16、、重組人IL-18(rhIL-18)調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體對Pfeiffer細胞的生物學作用:加入rhIL-18后c-myc mRNA和bcl-2mRNA表達顯著增加，而TP53mRNA和bax mRNA表達顯著降低，從而促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，抑制地塞米松的抗腫瘤作用，而加入抗IL-18后作用相反。
　　研究結(jié)論:
　　1、IL-18(rs1946518)和NFκB94ins/del(rs28362491)基因多態(tài)性是

17、影響淋巴瘤易感性的相關(guān)因素，CARD8(rs2043211)基因多態(tài)性對淋巴瘤的生存期有較大影響。
　　2、淋巴瘤患者NLRP3相關(guān)基因表達高于正常人，NLRP3炎癥小體通過其下游基因尤其是IL-18的作用，促進淋巴瘤細胞增殖，抑制淋巴瘤細胞凋亡，減弱地塞米松的抗腫瘤作用。
　　3、IL-18可活化NLRP3，促進淋巴瘤細胞增殖，抑制淋巴瘤細胞凋亡，減弱地塞米松的抗腫瘤作用?？笽L-18作用與之相反。
　　4、NLRP