氯喹抑制NLRP3炎癥小體活化介導其抗炎效應的機制研究.pdf

1、目的:
　　膿毒癥是感染所致的一種臨床綜合征，主要表現(xiàn)為因宿主免疫應答失調引發(fā)的多器官功能紊亂。膿毒癥是臨床危重癥病人死亡的首要因素之一，但目前尚無可靠有效的防治藥物用于臨床治療。業(yè)已證實，機體內過度的炎癥反應是導致膿毒癥發(fā)病和多器官功能紊亂的核心病理事件。因此，對炎癥反應的關鍵環(huán)節(jié)進行拮抗是膿毒癥藥物研發(fā)的重要方向。
　　炎癥小體是近年來發(fā)現(xiàn)的新型炎癥調控平臺，在機體炎癥發(fā)生中發(fā)揮關鍵調節(jié)作用，其中NLRP3炎癥小體是目前

2、研究最為廣泛的炎癥小體類型。近來發(fā)現(xiàn)，NLRP3的活化與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展關系密切。研究顯示多種誘發(fā)膿毒癥的重要病原體分子模式(PAMPs)都可在機內體激活NLRP3炎癥小體，介導IL-1家族炎癥因子成熟釋放并導致免疫細胞焦亡等的發(fā)生，因此它的過度活化在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。NLRP3炎癥小體的活化過程包括蛋白組分轉錄表達和蛋白復合物裝配。PAMPs激活模式識別受體（PRRs）下游胞內信號轉導途徑啟動蛋白組分的轉錄表達，又被稱為第

3、一信號(signal1)，如LPS。LPS被細胞TLR4識別后激活NF-κB和MAPK信號通路啟動炎癥因子前體和NLRP3轉錄表達。其他激活因子啟動蛋白復合物裝配，被稱為是第二信號(signal2)，如ATP。第二信號調控NLRP3炎癥小體復合物裝配的具體分子機制尚不清楚，但近來鉀離子外流模型得到更多的認可，ATP促進胞內鉀離子外流介導NLRP3、ASC和caspase-1組裝成蛋白嵌合體，激活炎癥小體下游效應。
　　氯喹最早作為

4、抗瘧疾藥物廣泛應用于臨床，近年來在類風濕性關節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫疾病中也有應用。我們課題組最先報道了氯喹對膿毒癥模型小鼠的保護作用，且發(fā)現(xiàn)該作用與其介導的TLR4通路的抗炎效應密切相關。在后續(xù)研究中，我們還發(fā)現(xiàn)氯喹通過影響蛋白泛素化系統(tǒng)抑制其炎癥效應，提示氯喹可能存在多重的抗炎機制。氯喹對膿毒癥模型小鼠的保護作用是否與NLRP3炎癥小體活化有關，具體分子機制是與signal1還是signal2有關，目前均不清楚，也無相關文獻報

5、道。因此，本課題首先在膿毒癥動物模型中展開氯喹對NLRP3活化的效應研究。進而在體外建立巨噬細胞NLRP3炎癥小體激活模型，從轉錄起始和裝配調控層面研究其調控NLRP3炎癥小體活化的分子機制。最終明確氯喹調控NLRP3炎癥小體活化的作用和分子機制，為擴大氯喹的適應癥提供實驗依據(jù)，也為基于炎癥小體抑制作用的抗膿毒癥藥物研究提供新思路。
　　方法:
　　1.氯喹體內抑制NLRP3炎癥小體活化及其介導膿毒癥模型小鼠保護效應的作用研

6、究
　　1.1.通過對BABL/c小鼠尾靜脈注射內毒素建立死亡率高于70％的膿毒癥動物模型。腹腔給藥的方式給予30mg/kg或10mg/kg劑量的氯喹，觀察記錄模型小鼠的7天生存情況。分別在LPS攻擊6h和24h后采集小鼠外周血，檢測血液中ALT和AST水平;在相同時相點獲取小鼠肝、脾、肺等組織進行HE染色觀察藥物對LPS介導的臟器損傷的影響，明確藥物對模型動物的保護作用。
　　1.2.在1.1建立的模型動物基礎上，給藥30

7、mg/kg劑量的氯喹，分別于LPS攻擊后6h、12h和24h采集小鼠外周血和腹腔灌洗液。ELISA檢測外周血中IL-1β和IL-18釋放水平。同時獲取小鼠肝、脾和肺等組織進行組織勻漿，檢測勻漿液中IL-1β和IL-18蛋白水平，capase-1活化水平和NLRP3蛋白表達水平，明確氯喹對NLRP3炎癥小體活化及其下游效應的作用。
　　2.氯喹抑制NLRP3炎癥小體活化的作用機制研究
　　2.1.體外分離誘導骨髓源巨噬細胞(B

8、MDMs)，激光共聚焦和流式細胞儀檢測F4/80陽性細胞率;通過LPS和ATP刺激建立體外LPS介導的NLRP3炎癥小體激活細胞模型;不同劑量氯喹處理細胞后檢測細胞上清中IL-1β和IL-18釋放水平;蛋白免疫印跡法(WB)檢測藥物作用后細胞裂解液和細胞上清中的ASC、caspase-1前體和caspase-1 p10表達水平;不同ATP作用時相點藥物影響細胞LDH釋放率;檢測藥物抑制其它NLRP3炎癥小體激活因子促進IL-1β釋放的影

9、響;在腹腔巨噬細胞系中觀察藥物對IL-1β釋放的影響;明確氯喹對LPS和ATP介導的巨噬細胞NLRP3炎癥小體活化的作用。
　　2.2.ELISA檢測氯喹對細胞內IL-1β和IL-18前體表達水平和細胞上清中的成熟釋放水平的影響;RT-qPCR檢測氯喹影響LPS介導的IL-1β和IL-18的轉錄水平;進一步檢測氯喹對NLRP3基因轉錄水平和蛋白表達水平的影響;明確氯喹對NLRP3炎癥小體活化信號一通路的作用。WB檢測氯喹影響LPS

10、介導的NF-κB p65磷酸化水平、IκBα磷酸化水平和IκBα總蛋白降解降解水平;激光共聚焦觀察NF-κB p65核轉位情況;WB檢測氯喹影響MAPK通路中ERK、P38和JNK的激活水平;明確氯喹作用于炎癥小體蛋白組分轉錄從而調控NLRP3炎癥小體活化的分子機制。
　　2.3.改變氯喹作用階段或洗滌細胞去除藥物后檢測IL-1β釋放變化;激光共聚焦觀察免疫熒光標記的ASC蛋白在胞內形成ASC specks，計算ASC speck

11、s陽性細胞百分率;不同濃度鉀離子影響氯喹抑制1L-1β釋放，檢測氯喹影響胞內鉀離子濃度，比較氯喹對鉀離子外流效應的影響，明確氯喹通過影響蛋白復合物裝配調控NLRP3炎癥小體活化。Affymetrix基因表達譜芯片檢測氯喹影響LPS介導的巨噬細胞活化的差異表達基因;GO富集分析鉀離子代謝相關的差異表達基因;RT-qPCR和WB檢測氯喹影響ATP1B3的基因表達水平和蛋白表達水平;WB檢測siATP1B3-1、siATP1B3-2、siAT

12、P1B3-3干擾后ATP1B3蛋白表達水平，確認siRNA對ATP1B3蛋白表達干擾作用;siATP1B3后對LPS和ATP激活的NLRP3炎癥小體的下游效應的影響;檢測siATP1B3后細胞IL-1β釋放、caspase-1激活水平，確認氯喹通過ATP1B3影響NLRP3炎癥小體活化的作用。
　　結果:
　　1.氯喹體內抑制NLRP3炎癥小體活化及其介導膿毒癥模型小鼠保護效應的作用研究
　　1.1.模型組小鼠7天生存

13、率低于30％，30mg/kg氯喹顯著提高模型組小鼠生存率(p=0.0155);模型組小鼠肺組織出現(xiàn)可見彌漫性出血、水腫，伴有散在炎細胞侵潤，氯喹明顯減輕該效應;氯喹顯著抑制模型動物體內升高的血清ALT和AST;表明氯喹減輕模型動物器官損傷，提高膿毒癥模型小鼠生存率。
　　1.2.血清學檢測結果顯示，模型組在6h、12h和24h的IL-1β和IL-18顯著高于生理鹽水對照組，氯喹顯著抑制IL-1β和IL-18釋放;同時，在腹腔灌洗液

14、中檢測到與血清學相似效應;在肝臟和肺組織中均檢測到模型組小鼠IL-1β和IL-18水平顯著上調，氯喹對該上調效應有顯著抑制作用;WB檢測結果顯示氯喹顯著抑制LPS攻擊引起的caspase-1激活;同時，在組織中還發(fā)現(xiàn)氯喹抑制模型組的NLRP3蛋白表達水平上調。表明氯喹抑制體內NLRP3炎癥小體激活及其下游效應。
　　2.氯喹抑制NLRP3炎癥小體活化的作用機制研究
　　2.1.體外分離誘導獲得純度較高的BMDMs中，氯喹劑量

15、-效應依賴性抑制LPS和ATP介導的巨噬細胞IL-1β和IL-18釋放;WB檢測結果顯示LPS和ATP激活caspase-1p10生成，氯喹顯著抑制該作用且不影響caspase-1前體和ASC蛋白表達;LPS和ATP介導細胞LDH快速釋放，氯喹顯著抑制該效應;氯喹能夠抑制nigericin介導的IL-1β成熟釋放;在腹腔巨噬細胞中也觀察氯喹具有相似的作用，表明氯喹下調巨噬細胞NLRP3炎癥小體活化，減少IL-1β和IL-18成熟釋放，抑

16、制細胞焦亡。
　　2.2.細胞內蛋白水平檢測結果提示氯喹抑制IL-1β和IL-18前體表達水平，通過RT-qPCR檢測確定氯喹通過抑制IL-1β和IL-18轉錄降低前體的表達;同時氯喹通過抑制Nlrp3轉錄水平降低NLRP3表達。LPS上調NF-κB p65(ser536)和IκBα蛋白磷酸化水平，促進IκBα蛋白降解，從而激活巨噬細胞內NF-κB信號通路，氯喹對NF-κB信號通路具有抑制效應;LPS明顯增強NF-κB p65核轉

17、位效應，氯喹明顯抑制NF-κB p65核轉位水平;另外氯喹抑制MAPK信號通路的ERK、JNK和p38的磷酸化激活水平。上述結果表明氯喹通過抑制NF-κB和MAPK信號通路抑制NLRP3蛋白組分的轉錄水平，從而負調控NLRP3炎癥小體活化。
　　結論:
　　1.氯喹體內能夠抑制NLRP3炎癥小體活化，降低IL-1家族炎癥因子成熟，進而發(fā)揮對膿毒癥模型小鼠的保護作用。
　　2.氯喹在體外抑制LPS和ATP介導的巨噬細胞N