氧化應(yīng)激敏感的TRPM2活化NLRP3炎癥小體參與白癜風(fēng)異常免疫應(yīng)答的機制研究.pdf

1、背景：白癜風(fēng)是一種常見的自身免疫性皮膚病，其黑素細胞破壞主要系CD8+T細胞介導(dǎo)的免疫損傷所致。文獻及我們以往的研究表明，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致白癜風(fēng)發(fā)病的重要原因，并證實角質(zhì)形成細胞在氧化應(yīng)激下，對白癜風(fēng)局部免疫微環(huán)境發(fā)揮重要調(diào)控作用，可誘導(dǎo)大量趨化因子如CXCL10、CXCL16分泌，通過與受體CXCR3、CXCR6結(jié)合介導(dǎo)CD8+T細胞向皮膚遷移，最終導(dǎo)致黑素細胞特異損傷。然而，角質(zhì)形成細胞在氧化應(yīng)激下如何調(diào)控趨化信號介導(dǎo)CD8+T細胞遷

2、移，以及對CD8+T細胞其他免疫功能的影響，仍有待進一步闡明。
　　NLRP3炎癥小體是由NLRP3、ASC及pro-caspase-1組成的復(fù)合物，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，活化后誘導(dǎo)促炎因子 IL-1β、IL-18的成熟與釋放。越來越多的研究證實NLRP3炎癥小體活化可誘導(dǎo)趨化因子分泌從而介導(dǎo)免疫細胞組織定向遷移，還可調(diào)控免疫細胞增殖、活化等過程，在多種自身免疫性疾病的啟動階段發(fā)揮重要作用。最近有學(xué)者提出NLRP3炎癥炎癥

3、小體參與白癜風(fēng)發(fā)病，但其在白癜風(fēng)中的具體功能作用及激活機制，尚不清楚。
　　研究證實，線粒體氧化應(yīng)激是促進NLRP3向線粒體轉(zhuǎn)位并激活NLRP3炎癥小體的重要和必要因素。進一步發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體組裝依賴胞內(nèi)鈣信號，細胞膜上鈣通道開放介導(dǎo)胞內(nèi)鈣超載，促進Ca2+內(nèi)流至線粒體，是導(dǎo)致線粒體損傷、NLRP3炎癥小體活化的關(guān)鍵機制。最新文獻發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激敏感的TRPM2通道，介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流，是線粒體氧化應(yīng)激產(chǎn)生的重要機制，也參與調(diào)

4、控氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的趨化因子表達、免疫細胞遷移等免疫過程。由此我們提出假說：白癜風(fēng)患者角質(zhì)形成細胞在氧化應(yīng)激下，TRPM2鈣通道開放介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流，誘導(dǎo)線粒體損傷，很可能是活化NLRP3炎癥小體的重要機制，NLRP3炎癥小體活化可能參與調(diào)控角質(zhì)形成細胞趨化因子表達、免疫細胞皮膚遷移等異常免疫反應(yīng)，最終導(dǎo)致黑素細胞破壞及白斑形成。
　　目的：研究白癜風(fēng)患者表皮氧化應(yīng)激活化角質(zhì)形成細胞NLRP3炎癥小體的機制，并闡明NLRP3炎癥小體活

5、化對白癜風(fēng)CD8+T細胞皮膚遷移及免疫效應(yīng)的調(diào)控作用。
　　方法：
　　1.采用免疫組化鑒定白癜風(fēng)皮損區(qū) NLRP3等炎癥小體表達情況，ELISA檢測白癜風(fēng)患者外周血IL-1β的表達及治療前后變化，并采用real-time PCR檢測皮損區(qū)IL-1β表達并分析其與H2O2蓄積、趨化因子CXCL10、CXCL16表達的關(guān)系。
　　2.在原代角質(zhì)形成細胞中，模擬體內(nèi)氧化應(yīng)激環(huán)境，采用流式檢測線粒體ROS生成、線粒體膜電位變

6、化；采用real-time PCR、Western Blot、細胞免疫熒光、ELISA等鑒定NLRP3表達、定位以及活化情況，明確氧化應(yīng)激對角質(zhì)形成細胞中NLRP3炎癥小體的激活作用。
　　3.在原代角質(zhì)形成細胞中，模擬體內(nèi)氧化應(yīng)激環(huán)境，Western Blot檢測TRPM2表達，采用Fluo-4探針檢測Ca2+內(nèi)流情況；在體外HaCaT細胞中轉(zhuǎn)染TRPM2 SiRNA干涉TRPM2表達，檢測Ca2+內(nèi)流、線粒體損傷及NLRP3炎

7、癥小體活化的各項指標(biāo)，明確TRPM2介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流是否為線粒體氧化應(yīng)激活化NLRP3炎癥小體所必需。
　　4.在HaCaT細胞中，采用SiRNA干涉HaCaT細胞中TRPM2、NLRP3表達，結(jié)合IL-1β中和抗體及IL-1R受體阻滯劑，ELISA檢測HaCaT細胞中趨化因子CXCL10及CXCL16的分泌，闡明角質(zhì)形成細胞中TRPM2活化的NLRP3炎癥小體對趨化因子表達的影響及機制。
　　5.分選進展期白癜風(fēng)患者外周

8、血CD8+T細胞，給予干涉TRPM2、NLRP3或中和IL-1β的HaCaT上清刺激處理，或阻斷CD8+T細胞表面IL-1R，采用流式細胞數(shù)檢測CD8+T細胞表面趨化因子受體CXCR3、CXCR6表達，明確角質(zhì)形成細胞中TRPM2活化的NLRP3炎癥小體對CD8+T細胞表面趨化因子受體表達的影響。
　　6.分選進展期白癜風(fēng)患者外周血CD8+T細胞，利用Transwell實驗，檢測干涉TRPM2、NLRP3的HaCaT上清對白癜風(fēng)患

9、者CD8+T細胞的遷移作用；并結(jié)合人重組趨化因子CXCL10、CXCL16試劑進行回復(fù)實驗，或流式分選消除CD8+T細胞上CXCR3及CXCR6表達，進行趨化實驗，明確TRPM2活化的NLRP3炎癥小體是否通過調(diào)控CXCL10-CXCR3及CXCL16-CXCR6信號影響白癜風(fēng)CD8+T細胞遷移。
　　7.分選進展期白癜風(fēng)患者外周血CD8+T細胞，給予干涉TRPM2、NLRP3的HaCaT上清刺激處理，流式檢測CD8+T細胞分泌效

10、應(yīng)分子IFN-γ的能力，分析TRPM2活化的NLRP3炎癥小體對白癜風(fēng)CD8+T細胞免疫效應(yīng)功能的調(diào)控作用。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組化檢測白癜風(fēng)皮損周組織中NLRP1、NLRP3、NLRC4以及AIM2的表達，發(fā)現(xiàn)以NLRP3上調(diào)最明顯，且主要表達于角質(zhì)形成細胞。ELISA結(jié)果顯示，進展期白癜風(fēng)患者外周血IL-1β（5.617±0.174pg/mL，n=30）較健康對照（6.821±0.367pg/mL，n=18）顯著下

11、調(diào)（P＜0.01）；采用標(biāo)準(zhǔn)療法治療2月后，外周IL-1β水平較治療前無明顯變化（n=30，P=0.7154）。但在白癜風(fēng)皮損周，IL-1βmRNA水平顯著上調(diào)2.04±0.28倍（P＜0.01），并與皮損局部高濃度的H2O2（r=0.6588，P=0.0055）、以及上調(diào)的CXCL10（r=0.6118，P=0.0118）、CXCL16（r=0.5853，P=0.0172） mRNA水平均呈正相關(guān)。
　　2.在原代角質(zhì)形成細胞中

12、，H2O2可呈劑量依賴方式誘導(dǎo)線粒體膜電位下降，促進線粒體ROS蓄積，導(dǎo)致線粒體損傷。此外，H2O2可顯著上調(diào)NLRP3 mRNA及蛋白水平，促進 NLRP3及其接頭分子ASC向線粒體轉(zhuǎn)位，誘導(dǎo) NLRP3炎癥小體中Caspase-1及IL-1β的剪切成熟，同時效應(yīng)分子IL-1β表達顯著增加。表明H2O2可激活角質(zhì)形成細胞中NLRP3炎癥小體。
　　3.在原代角質(zhì)形成細胞中，H2O2可誘導(dǎo)TRPM2表達上調(diào)，顯著促進Ca2+內(nèi)流；

13、而轉(zhuǎn)染TRPM2 SiRNA后，可顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流、線粒體膜電位下降及ROS生成；同時H2O2誘導(dǎo)的NLRP3、ASC線粒體轉(zhuǎn)位及Caspase-1、IL-1β的剪切也被阻斷。表明TRPM2介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流是氧化應(yīng)激活化NLRP3炎癥小體所必需。
　　4.干涉HaCaT細胞中TRPM2、NLRP3表達顯著降低HaCaT細胞中氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的趨化因子CXCL10、CXCL16分泌，以干涉TRPM2最為顯著；此外，利

14、用IL-1β中和抗體及IL-1R受體阻滯劑阻斷IL-1β/IL-R信號，也可抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的CXCL10、CXCL16表達。表明角質(zhì)形成細胞中TRPM2活化的NLRP3炎癥小體參與調(diào)控其自身分泌趨化因子，且至少部分是通過IL-1β/IL-R信號調(diào)控的。
　　5.分選進展期白癜風(fēng)患者外周CD8+T細胞，流式檢測發(fā)現(xiàn)HaCaT細胞氧化應(yīng)激模型上清可以顯著誘導(dǎo)CD8+T細胞表面趨化標(biāo)志CXCR3、CXCR6表達，而予以干涉了TRPM2

15、、NLRP3的HaCaT細胞氧化應(yīng)激模型上清處理后，相比未干涉組CXCR3、CXCR6表達均下調(diào)；此外，中和HaCaT細胞氧化應(yīng)激模型中IL-1β或阻斷CD8+T細胞表面IL-1R也有類似效果。表明角質(zhì)形成細胞中TRPM2活化的NLRP3炎癥小體也可調(diào)控CD8+T細胞表面趨化因子受體表達，并且是依賴IL-1β/IL-R信號的。
　　6.利用Transwell模型研究HaCaT細胞上清對白癜風(fēng)CD8+T細胞的遷移，發(fā)現(xiàn)干涉TRPM2

16、、NLRP3的HaCaT氧化應(yīng)激模型上清對進展期白癜風(fēng)患者CD8+T細胞的遷移能力顯著下降，而加入人重組趨化因子rhCXCL10、rhCXCL16進行回復(fù)實驗，發(fā)現(xiàn)CD8+T細胞趨化能力顯著上調(diào)。此外，消除白癜風(fēng)患者CD8+T細胞上CXCR3、CXCR6表達均會影響其遷移。該部分研究證實角質(zhì)形成細胞中TRPM2活化的NLRP3炎癥小體通過CXCL10-CXCR3、CXCL16-CXCR6信號調(diào)控白癜風(fēng)CD8+T細胞遷移。
　　7.

17、分選進展期白癜風(fēng)患者外周CD8+T細胞，流式檢測發(fā)現(xiàn)HaCaT細胞氧化應(yīng)激模型可以顯著誘導(dǎo)CD8+T細胞表達IFN-γ，而干涉了TRPM2、NLRP3的HaCaT細胞上清處理CD8+T細胞后，相比未干涉組其IFN-γ表達顯著減少。表明TRPM2活化的NLRP3炎癥小體對白癜風(fēng)CD8+T細胞表達IFN-γ、發(fā)揮免疫效應(yīng)起關(guān)鍵調(diào)控作用。
　　結(jié)論：通過本課題研究，我們首次明確氧化應(yīng)激條件下，角質(zhì)形成細胞中TRPM2介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流，誘

18、導(dǎo)線粒體損傷，從而活化NLRP3炎癥小體的具體機制；并率先揭示了TRPM2活化的NLRP3炎癥小體通過調(diào)控趨化因子CXCL10、CXCL16分泌、以及CD8+T細胞表面CXCR3、CXCR6的表達影響白癜風(fēng)CD8+T細胞皮膚遷移；此外還發(fā)現(xiàn)角質(zhì)形成細胞中TRPM2活化的NLRP3炎癥小體可以促進白癜風(fēng)CD8+T細胞分泌效應(yīng)分子IFN-γ，參與白癜風(fēng)發(fā)生及進展。本研究首次證實NLRP3炎癥小體在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的CD8+T細胞特異免疫應(yīng)答中發(fā)