納米氧化鋅對NLRP3炎性小體的激活作用及機制.pdf

1、背景:
　　納米氧化鋅（Zinc Oxide Nano-Particles，ZnO-NPs)是一種新型高功能無機精細產(chǎn)品，具有宏觀材料所不具備的表面效應、量子尺寸效應以及宏觀隧道效應、高分散性等特點，被廣泛應用于陶瓷、化工、電子、光學、生物、醫(yī)藥、國防等許多領域。與此同時，納米氧化鋅的毒性作用也受到了人們的廣泛關注。納米氧化鋅主要通過呼吸道進入機體，由于其具有較小粒徑，可進入到肺泡深部，誘導呼吸道上皮細胞活性氧（Reactive

2、Oxygen Species，ROS）生成量增多，誘發(fā)炎性反應。NLRP3（Nod-liker Recptor Protein3，NLRP3）炎性小體是炎性反應的重要組成部分，是由 NLRP3分子、凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD， ACS）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(cysteine-requiring aspartate prote

3、ase-1，caspase-1)組成的分子量約為700 kD的蛋白復合體，可以被ROS活化?；罨腘LRP3炎性小體可以切割炎性因子白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-18前體，促進其成熟釋放，從而誘導其他炎性因子的分泌，促進炎性反應的發(fā)展進程。研究表明核轉(zhuǎn)錄因子（Nuclear Factor Kappa B，NF-κB）可以調(diào)控NLRP3炎性小體的活化，促進炎性因子的分泌。然而，納米氧化鋅引發(fā)炎性反應中

4、NLRP3炎性小體是否被活化并發(fā)揮作用未見報道。
　　本課題選用人肺泡Ⅱ型上皮細胞（A549）作為研究對象，以納米氧化鋅顆粒物（ZnO-NPs）作為刺激物，研究 NLRP3炎性小體的活化在 ZnO-NPs誘發(fā)A549細胞產(chǎn)生炎性反應中的作用及機制。
　　方法:
　　1、ZnO-NPs對A549細胞的脂質(zhì)過氧化作用：
　　不同濃度（0、10、20、40μg/mL）ZnO-NPs刺激A549細胞4、8、24 h，染毒

5、結(jié)束后收集各組細胞。應用流式細胞儀檢測各組細胞內(nèi)ROS平均熒光信號強度（Mean Fluorescence Intensity，MFI）來反映各組細胞內(nèi)ROS水平；應用丙二醛（Malondialdehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）活性檢測試劑盒分別檢測各組細胞內(nèi)MDA含量和SOD活性。
　　2、ZnO-NPs對A549細胞內(nèi)NF-κB的活化作用：
　　不同濃度Zn

6、O-NPs刺激A549細胞24 h，染毒結(jié)束后收集各組細胞。應用蛋白印跡法（Western Blot，WB）檢測細胞內(nèi)磷酸化p65的表達水平以反映細胞內(nèi)NF-κB的活化水平。
　　3、ZnO-NPs對A549細胞內(nèi)NLRP3炎性小體的激活作用：
　　不同濃度ZnO-NPs刺激A549細胞12 h，染毒結(jié)束后收集各組細胞，應用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Real-time fluorescent quantitative Po

7、lymerase Chain Reaction，Real-time PCR）檢測NLRP3 mRNA的表達水平；ZnO-NPs刺激A549細胞24 h，染毒結(jié)束后收集各組細胞及培養(yǎng)上清，應用Western Blot檢測細胞內(nèi)NLRP3、Caspase-1活性小亞基 p10的蛋白表達水平；應用酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme Linked Immuno-sorbent Assay，ELISA）檢測A549細胞培養(yǎng)上清中炎性因子IL-1β、IL

8、-18的表達水平。
　　4、抑制劑對通路的影響：
　　4.1活性氧抑制劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）對NF-κB、NLRP3炎性小體活化的影響：
　　NAC預處理A549細胞后用ZnO-NPs刺激A549細胞24 h，染毒結(jié)束后收集各組細胞及培養(yǎng)上清。應用 Western Blot分別檢測各組細胞內(nèi)磷酸化 p65、NLRP3、caspase-1活性小亞基p10的蛋白表達量；應用EL

9、ISA檢測A549細胞培養(yǎng)上清中炎性因子IL-1β、IL-18的含量。
　　4.2 NF-κB抑制劑BAY11-7082（BAY）對ROS、NLRP3炎性小體表達水平的影響：
　　BAY11-7082預處理A549細胞后用ZnO-NPs刺激A549細胞8 h，染毒結(jié)束后收集各組細胞，應用流式細胞儀檢測細胞 ROS的表達水平；BAY11-7082預處理A549后用ZnO-NPs刺激A549細胞24 h，染毒結(jié)束后收集各組細胞及

10、培養(yǎng)上清，應用Western Blot檢測各組細胞內(nèi)NLRP3、caspase-1活性小亞基p10的表達量；應用ELISA檢測A549細胞培養(yǎng)上清中炎性因子IL-1β、IL-18的表達水平。
　　4.3 NLRP3抑制劑格列本脲（Glibenclamide，GEL）對炎性因子 IL-1β、IL-18的影響：
　　GEL預處理A549細胞后用ZnO-NPs刺激A549細胞24 h，染毒結(jié)束后收集各組細胞培養(yǎng)上清，應用ELISA

11、分別檢測細胞培養(yǎng)上清中炎性因子IL-1β、IL-18的含量。
　　結(jié)果:
　　1、ZnO-NPs對A549細胞的脂質(zhì)過氧化作用：
　　相同染毒劑量下，各組細胞ROS水平和MDA的含量隨著染毒時間的增加而升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；相同染毒時間下，隨著染毒劑量的增加，ROS水平與MDA含量也隨之增加，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。SOD的活性隨著染毒時間與劑量的增加呈下降趨勢，差異均具有統(tǒng)計學意義

12、（P＜0.05）。
　　2、ZnO-NPs對A549細胞NF-κB活化水平的影響：
　　WB結(jié)果顯示，0、10、20、40μg/mL劑量組磷酸化p65的相對表達水平分別為0.23、0.45、0.96、1.12；隨著染毒劑量的增加，NF-κB的活化水平呈現(xiàn)上升趨勢。
　　3、ZnO-NPs對A549細胞NLRP3炎性小體活化的影響：
　　3.1 ZnO-NPs對A549細胞NLRP3與caspase-1表達的影響：

13、
　　Real Time-PCR結(jié)果顯示NLRP3 mRNA的表達水平隨著染毒劑量增加而升高，各劑量組與對照組相比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Western Blot結(jié)果表明，隨著染毒劑量的增加，NLRP3炎性小體與Caspase-1活性小亞基p10的蛋白表達水平也隨之升高。
　　3.2 ZnO-NPs對A549細胞炎性因子IL-1β、IL-18表達水平的影響：
　　ELISA結(jié)果顯示，各組細胞炎性因子I

14、L-1β和IL-18的含量隨著染毒劑量的增加升高。與對照組相比較，20、40μg/mL劑量組IL-1β、IL-18的表達水平均升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與10μg/mL組相比較，40μg/mL劑量組IL-1β、IL-18的表達水平均升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　4應用抑制劑對信號通路的影響：
　　4.1 ROS抑制劑NAC對NF-κB、NLRP3炎性小體表達水平的影響：
　　與對照組比

15、較，ZnO-NPs刺激可明顯提高細胞內(nèi)磷酸化 p65、NLRP3與Caspase-1活性小基 p10的蛋白表達水平，可使細胞培養(yǎng)上清中的 IL-1β、IL-18的含量升高。NAC預處理可顯著降低ZnO-NPs誘導的細胞內(nèi)磷酸化p65、NLRP3、p10的蛋白高表達和IL-1β、IL-18的高表達。
　　4.2 NF-κB抑制劑BAY11-7082對ROS、NLRP3炎性小體表達水平的影響：
　　ZnO-NPs刺激8h后ROS

16、表達水平（用MFI表示）為9543.44±272.81，應用NF-κB抑制劑BAY11-7082后ROS表達水平為9042.65±314.19，兩組相比ROS水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。WB結(jié)果顯示，BAY11-7082預處理可顯著降低ZnO-NPs誘導的NLRP3與p10的高表達。ELISA結(jié)果顯示，ZnO-NPs刺激后細胞培養(yǎng)上清中炎性因子IL-1β、IL-18的表達水平分別為（1.60±0.09）μg/mL、（739.0

17、2±29.40）pg/mL，BAY11-7082預處理后IL-1β、IL-18的表達水平分別為（1.08±0.12）μg/mL、（331.27±70.65） pg/mL，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　4.3 NLRP3抑制劑格列本脲對炎性因子IL-1β、IL-18的影響：
　　ZnO-NPs刺激后細胞培養(yǎng)上清中炎性因子 IL-1β、IL-18表達水平分別為（1.60±0.09）μg/mL、（739.02±29.