IL-27對DSS小鼠結(jié)腸炎模型NLRP3炎性小體的影響.pdf

1、研究背景：
　　炎癥性腸病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)，包括潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)和克羅恩病(Crohn’s disease,CD)，是一組以反復(fù)發(fā)生與緩解為特點(diǎn)的慢性腸道炎癥。近年來 IBD發(fā)病率有所升高，但其具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前認(rèn)為可能與遺傳、環(huán)境、免疫等多因素密切相關(guān)。固有免疫是免疫系統(tǒng)識(shí)別自我非我的第一道防線，免疫細(xì)胞通過模式識(shí)別受體(PRRs)

2、識(shí)別危險(xiǎn)信號(hào)，如病原微生物等。NLRP3是胞內(nèi)模式識(shí)別受體之一，在中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞等均有表達(dá)，能夠和凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)、Caspase-1組成高分子量的蛋白復(fù)合體，稱為NLRP3炎性小體。多種危險(xiǎn)信號(hào)如微生物及其代謝產(chǎn)物，及內(nèi)外源性刺激物如尿酸、ATP、二氧化硅等均可激活NLRP3炎性小體，引起Caspase-1自剪切成為活化形式，從而控制著下游IL-1β和IL-18的成熟和分泌，參與固有免疫應(yīng)答，他

3、們強(qiáng)大的促炎作用直接影響宿主對感染和損傷的應(yīng)答。IL-27是是近年來研究較熱的一種細(xì)胞因子，是IL-12家族的新成員，其具有異二聚體結(jié)構(gòu)，由EB病毒誘導(dǎo)基因3(EBi3)和IL-27 p28構(gòu)成。IL-27主要來源于活化的抗原呈遞細(xì)胞（Antibody presenting cells,APCs），由樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等在微生物或其他免疫刺激物刺激下產(chǎn)生。IL-27可以抑制Th2及Th17應(yīng)答，促進(jìn)Treg及誘導(dǎo)抗炎因子IL

4、-10的產(chǎn)生，具有強(qiáng)大的免疫抑制作用。
　　目的：
　　通過不同劑量的IL-27對IBD模型小鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察IBD動(dòng)物模型的結(jié)腸組織學(xué)變化，檢測小鼠腸組織NLRP3炎性小體相關(guān)指標(biāo)及小鼠血清IL-1β、IL-18的表達(dá)水平，探討IL-27對IBD模型中NLRP3炎性小體的影響。
　　方法：
　　將48只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組，每組12只。
　　①對照組：自由飲水進(jìn)食，無特殊干預(yù)。
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5、DSS模型組：連續(xù)10天每天自由飲用以蒸餾水配制的3％DSS溶液，每兩天更換新的DSS溶液，自由取食。
　?、鄣蛣┝縄L-27組：在自由飲用DSS的基礎(chǔ)上，將500ng IL-27溶于去離子水300μL，每日每只小鼠腹腔注射IL-27溶液300μL。
　?、芨邉┝縄L-27組：在自由飲用DSS的基礎(chǔ)上，將1μg的IL-27溶于去離子水300μL，每日每只小鼠腹腔注射300μL。第12天處死小鼠，取血清ELISA檢測IL-1β

6、、IL-18濃度，取結(jié)腸組織HE染色、PCR及Western Blot檢測。
　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，所有數(shù)據(jù)用Levene檢驗(yàn)方法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(ANOVA)，對方差分析有意義者再采用LSD-t檢驗(yàn)法進(jìn)行兩兩比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P<0.05時(shí)被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Pearson積矩相關(guān)系數(shù)來描述變量之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：

7、
　　1．疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分
　　與對照組相比，DSS模型組小鼠出現(xiàn)腹瀉、便血及體重下降，DAI評(píng)分升高，高劑量IL-27組癥狀較模型組輕。四組的DAI評(píng)分有差異（F=54.6,P<0.05），模型組高于對照組(7.86±0.97 vs1.48±0.30)，高劑量 IL-27組低于模型組(6.61±0.92 vs7.86±0.97)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　2.組織學(xué)（HI）評(píng)分
　　與對

8、照組比較，模型組的結(jié)腸黏膜固有層有大量以淋巴細(xì)胞為主炎性細(xì)胞浸潤，血管增生，隱窩破壞。高劑量IL-27組鏡下表現(xiàn)較模型組輕，低劑量IL-27組較模型組改善不明顯。四組的HI評(píng)分有差異(F=89.1，P<0.05)，模型組高于對照組(6.52±0.67 vs0.49±0.31)，高劑量IL-27組低于模型組(4.68±0.64 vs6.52±0.67)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低劑量IL-27組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.免疫

9、組化檢測NLRP3在結(jié)腸的表達(dá)
　　四組結(jié)腸的NLRP3的表達(dá)有差異(χ2=11.1，P<0.05)，模型組高于對照組(75.0%vs16.7%)，高劑量 IL-27組低于模型組(25.0% vs75.0%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低劑量IL-27組與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4．qPCR檢測NLRP3和IL-1βmRNA在結(jié)腸的表達(dá)
　　四組結(jié)腸的NLRP3 mRNA的表達(dá)有差異(F=72.93，P<

10、0.05)，模型組高于對照組(6.17±0.56 vs1.35±0.44)，高劑量IL-27組低于模型組(3.91±0.83 vs6.17±0.56)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低劑量IL-27組與模型組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。
　　四組結(jié)腸的IL-1βmRNA的表達(dá)有差異(F=27.08，P<0.05)，模型組高于對照組(1.43±0.16 vs0.41±0.15)，高劑量IL-27組低于模型組(1.02±0.15 vs1

11、.43±0.16)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　5．免疫印跡法檢測Caspase-1在結(jié)腸的表達(dá)
　　四組結(jié)腸的Caspase-1 p10的表達(dá)有差異(F=5.4，P<0.05)，模型組高于對照組(0.72±0.14 vs0.39±0.13)，高劑量IL-27組低于模型組(0.48±0.16 vs0.72±0.14)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低劑量IL-27組與模型組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　6.E

12、LISA檢測血清中IL-1β和IL-18的表達(dá)
　　四組血清的IL-1β的表達(dá)有差異(F=50.42，P<0.05)，模型組高于對照組(118±2.7 vs102±6.5)，高劑量IL-27組低于模型組(86.0±4.36 vs118±2.7)，低劑量IL-27組同樣低于模型組(89.2±4.32 vs118±2.7)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。四組血清的IL-18的表達(dá)有差異(F=7.01，P<0.05)，模型組高于對照

13、組(86.5±7.79 vs70.2±7.04)，高劑量IL-27組低于模型組(69.3±5.08 vs86.5±7.79)，低劑量IL-27組低于模型組(73.4±6.47 vs86.5±7.79)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1．IL-27可以改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型。
　　2．IL-27可以下調(diào)結(jié)腸組織NLRP3、IL-1β前體的表達(dá)。
　　3．IL-27可以抑制NLRP3炎性小體