NLRP3炎性小體及其下游因子在特發(fā)性炎性肌病發(fā)病中的作用.pdf

1、目的:
　　(1)觀察多發(fā)性肌炎及皮肌炎患者血液和肌肉中NLRP3炎性小體及其下游因子的表達(dá);
　　(2)通過(guò)免疫干預(yù)特發(fā)性炎性肌病動(dòng)物模型，觀察NLRP3炎性小體及其下游因子的表達(dá)，以了解其治療作用。
　　方法:
　　(1)本研究納入多發(fā)性肌炎10例、皮肌炎12例和對(duì)照者24例，采集三組病例血液和肌肉標(biāo)本;采用ELISA方法測(cè)定其血清IL-1β和IL-18含量;同時(shí)采用qRT-PCR技術(shù)觀察其肌肉組織的IL-1

2、β、IL-18和NLRP3的mRNA表達(dá)，采用Westem blotting技術(shù)檢測(cè)其肌肉組織NLRP3和Caspase-1 p20的蛋白表達(dá);同時(shí)收集患者的人口學(xué)資料、病史、體征、血清CK、LDH值、肌電圖(EMG)檢查結(jié)果等;
　　(2)為了建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肌炎小鼠模型(EAM)，本研究選用10只BALB/c小鼠分為EMA組（n=5）和對(duì)照組(n=5);EAM組給予豚鼠骨骼肌勻漿與CFA的混合物皮下注射6周，;對(duì)照組給予等

3、量生理鹽水與CFA的混合物皮下注射6周。造模完成后，觀察動(dòng)物的臨床表現(xiàn)并評(píng)分，同時(shí)采用大小鼠抓力測(cè)定儀檢測(cè)造模后小鼠肢體的拉力，所得數(shù)據(jù)除以小鼠體重標(biāo)準(zhǔn)化后即為小鼠的肌力[肌力=拉力(g)/體重(g)];采集動(dòng)物模型的血液和肌肉標(biāo)本，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清肌酶含量，肌肉標(biāo)本經(jīng)冰凍切片，采用HE染色，觀察肌肉組織形態(tài)學(xué)并留取照片，以判斷EAM模型是否建立成功;
　　(3)BALB/c小鼠10只建模，分為EAM組(n=5)和對(duì)照

4、組(n=5)，建模成功后采集其血液和肌肉標(biāo)本。采用上述同樣的方法檢測(cè)動(dòng)物血清IL-1β和IL-18濃度，肌肉組織IL-1β、IL-18、Caspase-1與NLRP3的mRNA表達(dá)和Pro-caspase-1、Caspase-1 p20與NLRP3的蛋白表達(dá);
　　(4)BALB/c小鼠15只建模，分為EAM治療組(n=5)、EAM組(n=5)和對(duì)照組(n=5);建模成功后，EAM治療組小鼠給予糖皮質(zhì)激素溶液(0.2mg/ml)灌

5、胃治療，10mg/kg/次，每天一次，連續(xù)給藥7天，其余兩組小鼠給予等量生理鹽水灌胃治療。治療結(jié)束后2周，觀察動(dòng)物的臨床表現(xiàn)，同時(shí)采用上述同樣的方法檢測(cè)小鼠肢體肌力，血清肌酶含量，肌肉組織形態(tài)學(xué)，血清IL-1β和IL-18濃度，肌肉組織IL-1β、IL-18、Caspase-1與NLRP3的mRNA表達(dá)和Pro-caspase-1、Caspase-1 p20與NLRP3的蛋白表達(dá);
　　(5)數(shù)據(jù)以(X)±SD（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示

6、，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，GraphPad Prism6.0作圖。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，服從正態(tài)性和方差齊性的連續(xù)變量比較采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)，不服從正態(tài)性和方差齊性的連續(xù)變量比較采用Kruskal WallisH檢驗(yàn)或Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　(1)多發(fā)性肌炎、皮肌炎患者和對(duì)照組血清IL-1β濃度分別為26.49±7.79 ng/ml、25.

7、02±8.29 ng/ml和16.49±3.30 ng/ml，與對(duì)照組比較，多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者血清IL-1β含量顯著升高(P＜0.01)，但多發(fā)性肌炎與皮肌炎患者之間比較，無(wú)顯著差別(P=0.67);多發(fā)性肌炎、皮肌炎和對(duì)照組患者血清IL-18濃度分別為184.8±161.7ng/ml、214.74±198.11ng/ml和50.90±37.62ng/ml，與對(duì)照組比較，多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者血清IL-18濃度顯著升高(P＜0.01

8、)，但多發(fā)性肌炎與皮肌炎患者之間比較，無(wú)顯著差別(P=0.54);與內(nèi)參基因GAPDH比較計(jì)算后，得到IL-1β、IL-18和NLRP3的mRNA表達(dá)，與對(duì)照組比較，多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者肌肉組織IL-1β、IL-18和NLRP3的mRNA表達(dá)均顯著升高(P＜0.01);通過(guò)比較待測(cè)蛋白與GAPDH條帶灰度，western blotting結(jié)果顯示，多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者肌肉組織NLRP3炎性小體和Caspase-1 p20蛋白表達(dá)顯著

9、高于照組（P＜0.01）;
　　(2)EAM組小鼠臨床評(píng)分為2.3±0.2，對(duì)照組為0，提示EAM組小鼠臨床癥狀重于對(duì)照組小鼠。肌肉病理EAM組小鼠呈典型肌炎改變，即出現(xiàn)較多的肌纖維壞變和炎細(xì)胞浸潤(rùn)，而對(duì)照組動(dòng)物呈正常形態(tài)。EAM組CK含量（3246±478.7 IU/L）較對(duì)照組（507.6±138.2 IU/L）顯著升高(P＜0.01)。EAM組小鼠四肢肌力為7.1±0.9g/g，對(duì)照組為7.1±0.9g/g，有顯著差別(P=

10、0.0075);EAM組小鼠前肢肌力為3.8±0.4g/g，對(duì)照組為5.2±0.3g/g，也有顯著差別(P=0.016);結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，EAM組小鼠的四肢和前肢肌力均顯著降低;
　　(3)EAM組和對(duì)照組的小鼠血清中IL-1β濃度分別為36.77±3.54 ng/ml和6.26±0.77 ng/ml，與對(duì)照組相比，EAM組小鼠血清IL-1β含量極顯著升高(P＜0.001);EAM組和對(duì)照組小鼠血清中IL-18濃度分別為7

11、4.28±3.36 ng/ml和22.02±1.07 ng/ml，與對(duì)照組相比，EAM組小鼠血清lL-1β含量極顯著升高(P＜0.001);qRT-PCR結(jié)果顯示，EAM組肌肉組織IL-1β、IL-18、Caspase-1和NLRP3的mRNA表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P＜0.01);通過(guò)比較待測(cè)蛋白與GAPDH條帶灰度，western blotting結(jié)果顯示，EAM組小鼠肌肉組織中NLRP3、Pro-caspase-1和Caspase-

12、1 p20蛋白表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P＜0.01);
　　(4)EAM治療組小鼠與EAM組小鼠的臨床評(píng)分無(wú)顯著差別(1.9±0.1,2.1±0.1，P=0.2)，EAM治療組小鼠四肢和前肢肌力分別為7.6±0.7g/g和4.0±0.1 g/g，EAM組則分別為7.4±0.4g/g和3.7±0.2g/g，兩組小鼠肌力沒有顯著差別(P＞0.05);但EAM治療組小鼠CK值較對(duì)照組顯著降低（1148±237.61U/L vs.4146±

13、566.1 IU/L，P=0.0012），肌肉病理觀察顯示EAM治療組小鼠肌肉組織壞變及炎細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯;EAM治療組和EAM組小鼠血清IL-1β濃度分別為24.24±3.33ng/ml和38.08±3.31 ng/ml，兩組含量有顯著性差異(P=0.0185);EAM治療組和EAM組小鼠血清IL-18濃度分別為44.34±7.52ng/ml和93.2±10.39 ng/ml，兩組含量有顯著性差異(P=0.0052);qRT-PCR結(jié)果

14、顯示，EAM治療組肌肉組織IL-1β、IL-18和NLRP3的mRNA表達(dá)均顯著降低于EAM組(P＜0.05);通過(guò)比較待測(cè)蛋白與GAPDH條帶灰度，western blotting結(jié)果顯示，EAM治療組小鼠肌肉組織中NLRP3、Pro-caspase-1和Caspase-1 p20蛋白表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　(1)多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者肌肉組織和血液NLRP3炎性小體及其下游因子明顯上調(diào)，表