細(xì)胞因子TWEAK及BAFF在多發(fā)性肌炎和皮肌炎發(fā)病中的作用.pdf

1、特發(fā)性炎性肌病是一類主要累及骨骼肌組織的自身免疫性疾病，多發(fā)性肌炎和皮肌炎是最常見的兩個(gè)疾病亞型?；颊吲R床上突出表現(xiàn)為肌無力與肌肉耐力降低、血清肌酸激酶升高、產(chǎn)生自身抗體、肌肉組織中發(fā)生炎性細(xì)胞浸潤，還會(huì)累及肺臟、心臟、腎臟、皮膚等多個(gè)臟器。多發(fā)性肌炎和皮肌炎已成為危害我國人民群眾身體健康的重大疾病之一，但其病因和發(fā)病機(jī)制仍不明確?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為天然免疫、獲得性免疫、以及非免疫學(xué)機(jī)制共同作用，導(dǎo)致肌炎患者骨骼肌損傷。
　　腫瘤壞死因

2、子樣凋亡弱誘導(dǎo)物(TWEAK)是腫瘤壞死因子超家族成員，是一種多功能細(xì)胞因子，通過結(jié)合并活化其受體Fn14參與多種細(xì)胞生理過程的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)多種自身免疫性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、硬皮病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡中TWEAK表達(dá)異常，提示TWEAK在自身免疫病中可能具有重要的作用。但是，TWEAK-Fn14在多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者中的表達(dá)情況仍不清楚。因此，為了研究TWEAK-Fn14在多發(fā)性肌炎和皮肌炎發(fā)病機(jī)制中的可能作用，我們檢測了多發(fā)性肌炎和皮

3、肌炎患者血清及肌肉組織中TWEAK-Fn14的表達(dá)水平，并初步探討了TWEAK對成肌細(xì)胞的刺激效應(yīng)，為闡明TWEAK-Fn14在多發(fā)性肌炎和皮肌炎中的作用提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　現(xiàn)有的多發(fā)性肌炎和皮肌炎血清生物標(biāo)記物，包括血清肌酸激酶、自身抗體、細(xì)胞因子等，均不能理想的反映全部患者的疾病活動(dòng)情況。因此，研究和探索新的血清標(biāo)記物，對于更好的評估患者疾病活動(dòng)性、指導(dǎo)患者的臨床治療和預(yù)后評估，具有重要的意義。B細(xì)胞活化因子(BAFF)是腫瘤

4、壞死因子超家族成員之一，研究證實(shí)BAFF水平在多種自身免疫性疾病中表達(dá)顯著升高并且可能作為指示疾病活動(dòng)性的血清標(biāo)記物。但是，中國人群多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者血清BAFF表達(dá)水平及其與患者疾病活動(dòng)度的相關(guān)性仍不清楚。為此，本研究擬檢測多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者血清BAFF濃度并分析其臨床相關(guān)性;同時(shí)，通過設(shè)計(jì)橫斷面研究和隨訪研究，證實(shí)多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者血清BAFF濃度和患者疾病活動(dòng)度的相關(guān)性，進(jìn)而闡明血清BAFF濃度作為患者疾病活動(dòng)性評估的

5、血清生物標(biāo)記物的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　本研究獲得主要研究結(jié)果如下:
　　一.TWEAK及其受體Fn14在多發(fā)性肌炎和皮肌炎中的表達(dá)及在發(fā)病機(jī)制的作用
　　1.多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者血清TWEAK水平的檢測
　　通過檢測98例多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者、37例健康對照血清TWEAK濃度，發(fā)現(xiàn)患者組血清TWEAK水平（中位數(shù)442 pg/ml，range81-1385 pg/ml）顯著低于較健康對照組（中位數(shù)516 pg/

6、ml，range282-797 pg/ml，P＜0.001）;血清TWEAK濃度在多發(fā)性肌炎患者組和皮肌炎患者組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。臨床相關(guān)性分析顯示患者血清TWEAK濃度與自身抗體、血清CK濃度、患者的臨床癥狀（肺間質(zhì)病變、吞咽困難、技工手、雷諾現(xiàn)象等）均無顯著相關(guān)性(P均＞0.05)。
　　橫斷面研究結(jié)果顯示患者血清TWEAK濃度與疾病活動(dòng)性評分無顯著相關(guān)性（P均＞0.05）;對12例新發(fā)病患者治療前后的血清T

7、WEAK濃度和疾病活動(dòng)度評分進(jìn)行分析，結(jié)果顯示治療之后，患者疾病活動(dòng)性評分顯著下降(P＜0.01)，但是患者血清TWEAK水平并不隨著疾病活動(dòng)度下降而變化。
　　2.多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者肌肉組織中Fn14 mRNA表達(dá)水平顯著升高
　　取17例多發(fā)性肌炎、19例皮肌炎患者、以及10例無肌病創(chuàng)傷患者的骨骼肌組織，進(jìn)行定量RT-PCR方法檢測TWEAK、Fn14的mRNA水平，結(jié)果顯示，多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者肌肉TWEAK m

8、RNA水平與對照組無顯著差異(P＞0.05);而患者肌肉中Fn14 mRNA水平顯著高于健康對照(P＜0.01);并且，多發(fā)性肌炎患者組和皮肌炎患者組Fn14mRNA水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。我們發(fā)現(xiàn)，合并吞咽困難的多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者肌肉Fn14 mRNA水平顯著高于未合并吞咽困難的患者(P＜0.01)。此外，患者肌肉Fn14 mRNA水平與肌肉活動(dòng)性評分顯著相關(guān)(r=0.512，P＜0.01)，但是與總活動(dòng)性評分不相關(guān)(P

9、＞0.05)。
　　3.多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者骨骼肌組織中TWEAK、Fn14蛋白表達(dá)檢測
　　利用間接免疫熒光法檢測了10例多發(fā)性肌炎、13例皮肌炎、7例健康對照肌肉組織中TWEAK、Fn14蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示:多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者患者肌肉組織中，可檢測到高表達(dá)TWEAK和Fn14蛋白，健康對照肌肉組織中未檢測到TWEAK、Fn14蛋白的明顯表達(dá);此外，在多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者肌肉組織中，TWEAK蛋白主要由浸潤的淋巴

10、細(xì)胞表達(dá)，但是在肌細(xì)胞膜上也可以檢測到TWEAK蛋白，而Fn14主要表達(dá)于肌細(xì)胞膜表面。因此免疫熒光雙重染色共表達(dá)分析中，可見TWEAK和Fn14常常同時(shí)出現(xiàn)在肌細(xì)胞膜表面。
　　4.TWEAK刺激成肌細(xì)胞的功能研究
　　體外培養(yǎng)的人骨骼肌成肌細(xì)胞經(jīng)高濃度TWEAK蛋白(100ng/ml)刺激48小時(shí)后，Western Blot等方法檢測成肌細(xì)胞的MHC-Ⅰ類分子表達(dá)情況，以及成肌細(xì)胞再生分化、凋亡、自噬等水平。結(jié)果顯示經(jīng)T

11、WEAK蛋白刺激后，成肌細(xì)胞再生分化、凋亡水平均未發(fā)生明顯變化;但是，TWEAK蛋白刺激后，成肌細(xì)胞MHC-Ⅰ類分子表達(dá)顯著上調(diào);并且自噬相關(guān)蛋白LC3B和Beclin1表達(dá)升高，提示TWEAK刺激后，成肌細(xì)胞自噬程度顯著增強(qiáng)。
　　二.BAFF作為多發(fā)性肌炎和皮肌炎血清生物標(biāo)記物的臨床研究
　　1.多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者血清BAFF水平
　　采用定量ELISA法檢測41例多發(fā)性肌炎、51例皮肌炎患者、25例健康對照血

12、清中BAFF濃度，結(jié)果顯示多發(fā)性肌炎患者(中位數(shù)1627.5 pg/ml，range239.2-19950 pg/ml，P＜0.001)和皮肌炎患者(中位數(shù)1582.5 pg/ml，range506.5-18360 pg/ml，P＜0.001)血清BAFF水平均顯著高于健康對照(中位數(shù)842pg/ml，range512-1354 pg/ml)。另外，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，多發(fā)性肌炎患者組和皮肌炎患者組之間血清BAFF水平無顯著差異(P＞0.05

13、)。
　　2.患者血清BAFF水平與臨床癥狀及實(shí)驗(yàn)室檢查的相關(guān)性分析
　　多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者血清BAFF濃度與臨床表現(xiàn)相關(guān)性分析結(jié)果顯示合并ILD患者組間血清BAFF濃度(49例PM/DM患者，中位數(shù)2472 pg/ml，range497.5-19950 pg/ml)顯著高于未合并ILD患者組(43例PM/DM患者，中位數(shù)1105 pg/ml，range239.2-6150pg/ml)(P＜0.001)。四格表x2檢驗(yàn)結(jié)

14、果顯示，血清BAFF濃度升高的患者合并ILD的比例顯著高于血清BAFF濃度正常的患者(x2value=20.886,P＜0.001)。根據(jù)患者的其它臨床癥狀如吞咽困難、雷諾現(xiàn)象、技工手、關(guān)節(jié)炎出現(xiàn)與否進(jìn)行分組，結(jié)果顯示組間血清BAFF水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0.05）。
　　多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者血清BAFF濃度與實(shí)驗(yàn)室檢查相關(guān)性分析結(jié)果顯示ANA陽性患者組血清BAFF濃度(39例患者，中位數(shù)1929 pg/ml，rang

15、e506.5-19950 pg/ml)顯著高于ANA陰性組患者（53例患者，中位數(shù)1533pg/ml，range239.2-12865 pg/ml）(P＜0.05);抗Jo-1抗體陽性組患者血清BAFF濃度(21例患者，中位數(shù)3838pg/ml，range1385.5-19950 pg/ml)顯著高于抗Jo-1抗體陰性組患者（71例患者，中位數(shù)1348.5 pg/ml，range239.2-18360 pg/ml）(P＜0.001);并

16、且患者的血清BAFF水平與血清抗Jo-1抗體濃度具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(r=0.822，P＜0.001)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者血清BAFF水平與血清CK濃度呈顯著性正相關(guān)（r值分別為0.675，0.723，P均＜0.01）。
　　對49例多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者的血清BAFF濃度和淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者血清BAFF濃度與CD3+T細(xì)胞數(shù)呈顯著性負(fù)相關(guān)(r=-0.334，P＜0

17、.05)，與CD3+CD4+T細(xì)胞數(shù)顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.302，P＜0.05)，與CD3+CD8+T細(xì)胞數(shù)顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.320，P＜0.05)，并且與CD19+CD5-B細(xì)胞數(shù)顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.322，P＜0.05)。此外，血清BAFF濃度與NK細(xì)胞數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(r=0.047，P＞0.05)。
　　3.患者血清BAFF水平與疾病活動(dòng)度的相關(guān)性分析:橫斷面研究
　　在收集患者血清標(biāo)本的同時(shí)，采用肌炎活動(dòng)評估

18、視覺模擬評分(MYOACT)工具對患者的疾病活動(dòng)度分別進(jìn)行評分，經(jīng)Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)分析，結(jié)果顯示多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者組血清BAFF濃度都和其MYOACT總疾病活動(dòng)度評分呈顯著正相關(guān)（r值分別為0.481、0.536;P均＜0.01）;并且血清BAFF濃度還與肌肉疾病活動(dòng)度正相關(guān)（r分別為0.257、0.354，P均＜0.05）。此外，對于皮肌炎患者，我們還發(fā)現(xiàn)血清BAFF濃度與皮膚疾病活動(dòng)度顯著相關(guān)(r=0.354，P＜0.

19、05)。
　　4.患者血清BAFF水平與疾病活動(dòng)度的相關(guān)性分析:隨訪研究
　　隨訪研究中，我們對24名多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者進(jìn)行隨訪，每名患者的隨訪次數(shù)為2-7次不等，隨訪時(shí)間間隔在6個(gè)月至6年不等，每次隨訪均收集患者的血清標(biāo)本，同時(shí)對患者疾病活動(dòng)度進(jìn)行MYOACT評分。其中20名患者被隨訪了超過2年，并且每名患者隨訪次數(shù)超過3次。對隨訪研究中收集到的73份血清標(biāo)本和對應(yīng)的疾病活動(dòng)度評分進(jìn)行相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)患者血清BAF

20、F濃度和患者M(jìn)YOACT總疾病活動(dòng)度評分顯著正相關(guān)(r=0.68， P＜0.001)，并且和MYOACT肌肉活動(dòng)度評分同樣顯著正相關(guān)(r=0.533， P＜0.001)。22名新發(fā)病未治療的患者，經(jīng)治療達(dá)到緩解期后，隨著疾病活動(dòng)度評分顯著下降(P＜0.001)，患者血清BAFF濃度也顯著降低(P＜0.001);并且治療前后患者血清BAFF濃度下降值和疾病活動(dòng)度評分下降值具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(r=0.434,P＜0.05)。
　　總

21、之，本研究結(jié)果表明多發(fā)性肌炎和皮肌炎患者TWEAK-Fn14表達(dá)異常，尤其是在肌肉組織中，TWEAK-Fn14表達(dá)顯著上調(diào)，提示多發(fā)性肌炎和皮肌炎骨骼肌組織中浸潤的淋巴細(xì)胞可能通過表達(dá)炎性細(xì)胞因子TWEAK，與肌細(xì)胞表面高表達(dá)的Fn14相互作用，活化下游信號(hào)通路，誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞損傷。通過體外實(shí)驗(yàn)，我們還證實(shí)TWEAK蛋白刺激后，成肌細(xì)胞MHC-Ⅰ類分子和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)顯著升高，進(jìn)一步提示TWEAK-Fn14參與多發(fā)性肌炎和皮肌炎的骨骼