NLRP3炎性小體在2型糖尿病腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的變化及機(jī)制研究.pdf

1、目的：NLRP3炎性小體是大分子蛋白復(fù)合體，能夠識(shí)別多種危險(xiǎn)刺激信號(hào)，募集并激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(cysteinyl aspartate specificproteinase-1，casepase-1)，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥因子白介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）和白介素-18（Interleukin-18，IL-18）的釋放，是機(jī)體固有免疫的一部分。目前研究發(fā)現(xiàn)炎性小體在多種炎性相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用

2、，如糖尿病腎病、視網(wǎng)膜病、自身免疫性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、再灌注損傷等。2型糖尿病引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷主要包括認(rèn)知障礙和腦血管管疾病。以往研究表明NLRP3炎性小體與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病關(guān)系密切，但是炎性小體在2型糖尿病腦微血管的損傷中是否起作用，及作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過觀察大鼠腦組織中NLRP3的分布，及高糖處理小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，檢測細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白，來探討NLRP3炎性小體在高糖作用下的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的變化及變化機(jī)制。

3、>　　方法：
　　(1)飼養(yǎng)6月齡雄性Wistar大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，自發(fā)性2型糖尿病(goto-kakizaki，GK)大鼠作為實(shí)驗(yàn)組，每組各5只，采用免疫組織化學(xué)方法觀察腦組織中NLRP3的表達(dá)及空間分布。
　　(2)體外培養(yǎng)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。不同葡萄糖濃度培養(yǎng)基模擬體內(nèi)2型糖尿病內(nèi)環(huán)境，活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)作為抑制劑，將細(xì)胞分為對(duì)照組（培養(yǎng)

4、基糖濃度5.6mmol/L）、高糖1組(HG1組，培養(yǎng)基糖濃度10mmol/L)、高糖2組(HG2組，培養(yǎng)基糖濃度20mmol/L)、高糖3組（HG3組，培養(yǎng)基糖濃度30mmol/L）及高糖+NAC組（HG+NAC組，目的蛋白表達(dá)較明顯組的糖濃度組內(nèi)按照1∶1000預(yù)先加入NAC）。
　　(3)采用Western blotting法檢測小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞各組硫氧還蛋白交互蛋白(TXNIP)和NLRP3的表達(dá)，采用ELISA法檢測

5、各組細(xì)胞中的IL-1β的水平;采取流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估對(duì)照組、HG3組、HG+NAC組ROS的含量。
　　(4)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所得數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組間的比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，多組間的比較應(yīng)用單因素方差分析。所得P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　(1) NLRP3主要分布于GK大鼠腦皮層及皮層下組織的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和微/小血管管壁。與Wistar大鼠相比，GK大鼠的陽染強(qiáng)度，

6、陽染血管數(shù)均有增加(P＜0.05);
　　(2)與對(duì)照組相比，HG1組、HG2組、HG3組TXNIP、NLRP3的表達(dá)有所增加(P＜0.01)，尤以HG3組蛋白表達(dá)增加最明顯。
　　(3)與對(duì)照組相比，HG1組、HG2組、HG3組細(xì)胞內(nèi)IL-1β水平有所增高(P＜0.01)。
　　(4)與對(duì)照組相比，HG3組ROS的含量增加(P＜0.01);給予ROS清除劑后，與HG3組相比， HG+NAC組細(xì)胞內(nèi)ROS含量下降(P＜

7、0.01)，TXNIP、NLRP3表達(dá)水平下降(p＜0.01)，細(xì)胞內(nèi)IL-1β水平下降(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　(1)高糖可促進(jìn)NLRP3和TXNIP的蛋白表達(dá)，并隨糖濃度的增加而表達(dá)增高。
　　(2)高糖各組IL-1β的水平含量增加，說明NLRP3炎性體被激活。
　　(3)高糖可導(dǎo)致腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生過多ROS。給予ROS清除劑后，高糖組細(xì)胞內(nèi)的ROS含量下降，且細(xì)胞內(nèi)的TXNIP和NLRP3的蛋