NLRP3炎癥小體對(duì)糖尿病性心肌病的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：NLRP3基因沉默改善糖尿病性心肌病的機(jī)制研究
　　研究背景：
　　糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是由糖尿病引起的，并以心肌重構(gòu)和心功能下降為特征，最終導(dǎo)致心力衰竭的心肌病變。糖尿病狀態(tài)下，高糖刺激活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成增多被認(rèn)為是DCM發(fā)生和發(fā)展的重要原因。過(guò)多的ROS刺激多種炎癥因子表達(dá)升高，如核因子kB(nuclear f

2、actor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-kB)、硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting/inhibiting protein，TXNIP)及炎癥小體。既往研究表明，炎癥小體與胰島素抵抗、2型糖尿病及糖尿病并發(fā)癥關(guān)系密切。但目前炎癥小體在DCM中的作用及其調(diào)控機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　炎癥小體是一類(lèi)分布于細(xì)胞胞漿中的蛋白復(fù)合體，它可

3、以感受細(xì)胞內(nèi)多種與免疫及死亡相關(guān)的信號(hào)刺激，參與細(xì)胞功能調(diào)控。目前已發(fā)現(xiàn)多個(gè)炎癥小體家族成員，主要包括:NLRs(nucleotide binding oligomerization domain-like receptors)家族及AIM2(absent in melanoma 2)家族。NLRP3(NOD-like receptor protein 3)是NLRs家族中的一員。當(dāng)接收到相關(guān)信號(hào)刺激后，NLRP3將與含CARD結(jié)構(gòu)域的

4、凋亡相關(guān)顆粒樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1，caspase-1)組成炎癥復(fù)合體，促進(jìn)caspase-1前體(pro-caspase-1)的自我剪切，形成具有活性的caspase-1p20/p10復(fù)合物，最終促進(jìn)白介素1β(i

5、nterleukin1β，IL-1β)前體蛋白pro-IL-1β水解成具有活性的IL-1β。既往研究表明，IL-1β在心肌細(xì)胞凋亡中具有重要作用。
　　NLRP3炎癥小體的異常激活通常表現(xiàn)在兩個(gè)方面:一方面，NLRP3表達(dá)上調(diào);另一方面，NLRP3炎癥小體形成復(fù)合物，促進(jìn)caspase-1及IL-1β等效應(yīng)分子的產(chǎn)生。在巨噬細(xì)胞中，NF-kB可促進(jìn)NLRP3表達(dá)上調(diào)。在HEK293T細(xì)胞中，TXNIP可促進(jìn)NLRP3炎癥復(fù)合物的形

6、成，最終促進(jìn)caspase-1及IL-1β等效應(yīng)分子的產(chǎn)生。但是在高糖刺激的心肌細(xì)胞中，NF-kB及TXNIP是否與NLRP3炎癥小體的激活相關(guān)，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　近期研究顯示，caspase-1除了可以促進(jìn)IL-1β成熟外，還可以促進(jìn)細(xì)胞程序性死亡，這一過(guò)程被稱(chēng)為“細(xì)胞焦亡(pyroptosis)”。細(xì)胞焦亡是一種與炎癥相關(guān)，依賴(lài)于caspase-1的程序性死亡方式。焦亡的細(xì)胞同時(shí)具備細(xì)胞凋亡及細(xì)胞壞死的部分形態(tài)特征。這主要

7、表現(xiàn)在:細(xì)胞焦亡存在DNA片段化損傷，并在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的粘性末端標(biāo)記檢測(cè)(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL)中呈現(xiàn)陽(yáng)性;細(xì)胞焦亡時(shí)胞膜完整性消失，胞內(nèi)炎癥物質(zhì)會(huì)通過(guò)膜上的孔隙釋放到細(xì)胞間質(zhì)，胞外物質(zhì)會(huì)從孔隙滲入胞漿，促進(jìn)細(xì)胞器及細(xì)胞漿腫脹，最終導(dǎo)致細(xì)胞破裂。因此，不能通過(guò)完整細(xì)胞膜而只能通過(guò)

8、形成孔隙的胞膜的染料可將活細(xì)胞與焦亡細(xì)胞區(qū)分開(kāi)，如EthD-Ⅲ染料，它可將焦亡細(xì)胞染成陽(yáng)性，但不能將正常細(xì)胞染色。焦亡現(xiàn)象最初是在巨噬細(xì)胞及樹(shù)突細(xì)胞等髓系細(xì)胞受到病原體刺激后觀(guān)察到的。近期研究顯示，一些非病原體也可刺激非髓系細(xì)胞出現(xiàn)焦亡現(xiàn)象。但是，高糖刺激的心肌細(xì)胞是否發(fā)生焦亡，目前未見(jiàn)報(bào)道。
　　在糖尿病小鼠及大鼠模型中，心肌組織的電鏡結(jié)果顯示大量心肌細(xì)胞呈現(xiàn)與焦亡細(xì)胞類(lèi)似的形態(tài)特征，如線(xiàn)粒體腫脹空泡化、肌纖維紊亂溶解、細(xì)胞腫脹

9、、及細(xì)胞膜模糊不清等。此外，我們?cè)陬A(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞焦亡關(guān)鍵因子caspase-1在DCM大鼠模型心肌組織中表達(dá)升高。據(jù)此，我們提出假設(shè):糖尿病狀態(tài)下，心肌細(xì)胞ROS生成增多。ROS通過(guò)NF-kB及TXNIP促進(jìn)NLRP3炎癥小體過(guò)度激活。NLRP3炎癥小體的異常激活通過(guò)促進(jìn)心肌間質(zhì)炎癥反應(yīng)、心肌細(xì)胞焦亡及心肌纖維化等途徑導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)和功能異常。
　　研究目的：
　　(1)建立2型DCM模型，探究NLRP3炎癥小體在DCM病程

10、不同階段的表達(dá)水平;
　　(2)利用NLRP3-miRNA慢病毒對(duì)DCM大鼠進(jìn)行體內(nèi)干預(yù)，探究NLRP3炎癥小體在DCM中的作用;
　　(3)探究NLRP3炎癥小體影響DCM發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制。
　　研究方法：
　　2型糖尿病大鼠模型
　　將120只5周齡雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機(jī)分為4組（每組30只）:對(duì)照組（control組）、糖尿病組（DM組）、糖尿病+空載體慢病毒組（DM+ve

11、hicle組）及糖尿病+NLRP3-miRNA慢病毒組（DM+NLRP3-miRNA組）。Control組給予基礎(chǔ)飲食，主要成分為:5％脂質(zhì)，不添加膽固醇。其余3組給予高脂飲食喂養(yǎng)，主要成分為:16％脂質(zhì)及0.25％膽固醇。4周后4組大鼠均行腹腔葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(Intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)及腹腔胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(Intraperitoneal insulin tolerance

12、 test，IPITT)。DM組、DM+vehicle組及DM+NLRP3-miRNA組出現(xiàn)胰島素抵抗的大鼠接受單次腹腔STZ注射，劑量為35mg/kg。1周后，檢測(cè)4組大鼠的空腹血糖(BG)及胰島素(insulin，INS)，計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(ISI)，ISI=In[(INS×BG)-1]。DM組、DM+vehicle組及DM+NLRP3-miRNA組大鼠連續(xù)兩次空腹血糖≥11.1mmol/L，且存在胰島素抵抗則認(rèn)為2型糖尿病造模成

13、功。
　　糖尿病性心肌病模型
　　糖尿病大鼠造模成功后，繼續(xù)給予高脂喂養(yǎng)。至STZ注射后8周，檢測(cè)大鼠心功能，糖尿病大鼠出現(xiàn)左室舒張功能障礙則提示開(kāi)始進(jìn)展為DCM。至STZ注射后16周，檢測(cè)大鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能，糖尿病大鼠心臟組織呈現(xiàn)心肌間質(zhì)纖維化及左室肥厚的，并出現(xiàn)左室收縮及舒張功能障礙，則提示DCM模型已經(jīng)成功建立。
　　基因沉默技術(shù)
　　根據(jù)RNAi干擾技術(shù)的原則，設(shè)計(jì)4對(duì)針對(duì)大鼠NLRP3基因的miRNA片

14、段，并分別構(gòu)建4對(duì)pcDNA6.2-GW/EmGFP-NLRP3-miRNA質(zhì)粒，經(jīng)篩選后，選擇沉默效率最高的質(zhì)粒，隨后構(gòu)建pDONR221-EmGFP-NLRP3-miRNA重組穿梭質(zhì)粒，最終構(gòu)建pLenti6.3—EmGFP-NLRP3-miRNA慢病毒載體。
　　慢病毒干預(yù)
　　在STZ腹腔注射8周后，分別給予DM+vehicle組及DM+NLRP3-miRNA組慢病毒空載體(vehicle)或NLRP3-miRNA慢

15、病毒(NLRP3-miRNA)干預(yù)8周。病毒干預(yù)8周后，對(duì)DM+vehicle組及DM+NLRP3-miRNA組全部大鼠實(shí)施安樂(lè)死，隨機(jī)抽取部分control及DM組大鼠（每組10只）實(shí)施安樂(lè)死。立即心臟取材，行冰凍切片檢測(cè)心肌病毒轉(zhuǎn)染效率。
　　NLRP3炎癥小體表達(dá)趨勢(shì)
　　Control組及DM組大鼠，分別在STZ注射后的第0、4、8、12、16及20周時(shí)取材，每組取3只，然后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。
　　血清學(xué)檢測(cè)

16、
　　待實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，大鼠饑餓過(guò)夜，抽取外周靜脈血，分別檢測(cè)血清中血糖(bloodglucose)、甘油三酯(triglyceride，TG)及總膽固醇(totalcholesterol，TC)含量。
　　酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay，ELISA)
　　利用ELISA測(cè)定大鼠外周血血清中胰島素的水平。
　　心臟彩超
　　大鼠經(jīng)10％水合氯醛麻醉后，行經(jīng)胸心臟彩

17、超，收集LVEDd、LVEF、F/S、E/A及E'/A'等數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)大鼠左室功能。
　　組織學(xué)檢測(cè)
　　大鼠實(shí)施安樂(lè)死后，立即心臟取材，隨后稱(chēng)重、測(cè)量心臟大小并留取圖像。于乳頭肌水平橫切心臟，制成石蠟切片，于乳頭肌平面連續(xù)切片，行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosinstaining，H&E)染色后留取圖像。
　　心肌纖維化
　　對(duì)左室心肌組織行Masson染色、天狼猩紅染色，使用圖像分析軟件對(duì)染色結(jié)果進(jìn)

18、行分析，評(píng)價(jià)左室心肌纖維化程度。
　　透射電鏡
　　大鼠實(shí)施安樂(lè)死后，立即取出心臟，于左室壁取1mmβ小組織塊，立即放入戊二醛固定液中，為透射電鏡下觀(guān)察左室心肌超微結(jié)構(gòu)做準(zhǔn)備。
　　免疫組織化學(xué)
　　利用免疫組織化學(xué)的方法，觀(guān)察caspase-1及IL-1β在組織中的分布。
　　實(shí)時(shí)定量T-PCR
　　取新鮮左室心肌組織，利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR的方法檢測(cè)大鼠左室心肌中NLRP3，ASC，caspas

19、e-1及IL-1βmRNA表達(dá)水平。
　　Westernblot
　　取新鮮左室心肌組織，利用Westemblot方法檢測(cè)大鼠左室心肌中TXNIP、NF-kB、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1及IL-1β的表達(dá)。
　　TUNEL檢測(cè)
　　利用TUNEL檢測(cè)大鼠左室組織中，心肌細(xì)胞核出現(xiàn)DNA損傷的情況。
　　細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)
　　培養(yǎng)大鼠H9c2心肌細(xì)胞系，分為3組:基

20、礎(chǔ)糖培養(yǎng)組（control組）、中等濃度糖刺激組（medianglucose，MG組）及高濃度糖刺激組（highglucose，HG組）。在進(jìn)行干預(yù)前，利用無(wú)血清基礎(chǔ)糖培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓處理。隨后給予含不同濃度葡萄糖的培養(yǎng)基進(jìn)行不同時(shí)間梯度的干預(yù)。在ROS抑制實(shí)驗(yàn)中，我們選擇N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)作為抑制劑對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理。
　　心肌細(xì)胞病毒轉(zhuǎn)染
　　利用vehicle或NLRP3-mi

21、RNA慢病毒對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，以探究NLRP3在心肌細(xì)胞中的作用及調(diào)控機(jī)制。
　　免疫熒光
　　利用免疫熒光技術(shù)觀(guān)察caspase-1在心肌細(xì)胞中的分布。
　　Caspase-1活性檢測(cè)
　　利用caspase-1活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)高糖刺激下caspase-1的活性。
　　ROS檢測(cè)
　　利用DCFH-DA檢測(cè)高糖刺激下心肌細(xì)胞ROS的產(chǎn)生。
　　細(xì)胞焦亡檢測(cè)
　　利用TUNEL檢測(cè)心肌

22、細(xì)胞核DNA損傷，利用EthD-Ⅲ染色檢測(cè)心肌細(xì)胞胞膜損傷，利用calcein-AM檢測(cè)細(xì)胞活性。
　　數(shù)據(jù)分析
　　利用SPSSv18.0處理數(shù)據(jù)，連續(xù)變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤來(lái)表示。利用單因素方差分析(one-wayANOVA)和Tukey-Kramerposthoc檢驗(yàn)比較多組間的連續(xù)變量。利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組間的連續(xù)變量。當(dāng)p＜0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：
　　高脂飲食4周可誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)胰

23、島素抵抗
　　IPGTT結(jié)果顯示，與基礎(chǔ)飲食相比，高脂喂養(yǎng)大鼠4周后，在IPGTT的0min、30min、60min、120min時(shí)血糖值均明顯升高(p＜0.05～p＜0.01);血糖曲線(xiàn)下面積(AUC)明顯增大(p＜0.01)。IPITT實(shí)驗(yàn)也呈現(xiàn)類(lèi)似結(jié)果(p＜0.05～p＜0.01)。
　　NLRP3炎癥小體及IL-1β在糖尿病性心肌病中表達(dá)增高
　　與對(duì)照組相比，糖尿病大鼠在STZ注射后第4或第8周起即出現(xiàn)NLR

24、P3、ASC、caspase-1及IL-1β3表達(dá)升高(p＜0.01)。此外，NLRP3炎癥小體各組分及IL-1β的mRNA水平多在STZ注射后第8周時(shí)達(dá)到頂峰，并持續(xù)高表達(dá)至第20周(p＜0.01)。與control組相比，NLRP3、ASC、pro-caspase-1、活化的caspase-1（caspase-1p20）及活化的IL-1β(IL-1βp17)在DM組中表達(dá)升高，且多在STZ注射后第8周達(dá)到頂峰，并持續(xù)高表達(dá)至第20周

25、(p＜0.01)。
　　NLRP3基因沉默不能改善糖尿病引起的代謝異常
　　在DM組大鼠中，血糖、血脂及胰島素水平均顯著高于control組(p＜0.01)，胰島素敏感指數(shù)顯著低于control組(p＜0.01)。利用NLRP3-miRNA進(jìn)行體內(nèi)干預(yù)后，并不能改善糖尿病引起的代謝異常。
　　基因干預(yù)能有效抑制心肌組織NLRP3表達(dá)
　　與vehicle干預(yù)組相比，NLRP3-miRNA干預(yù)后，心肌組織中NLRP

26、3的mRNA及蛋白水平明顯降低(p＜0.01)。此外，心肌組織中caspase-1和IL-1β的表達(dá)也明顯降低(p＜0.01)。免疫組化結(jié)果顯示，在糖尿病大鼠的心肌組織中，caspase-1主要分布在細(xì)胞核周?chē)?，IL-1β主要呈彌散分布(p＜0.01)。
　　NLRP3基因沉默可改善DCM左室功能異常
　　與control組比較，DM組的LVEF、FS、E/A及E'/A'均降低(p＜0.01)，LVEDd增大(p＜0.01)

27、。將NLRP3基因沉默后，糖尿病引起的LVEF、FS、E/A及E'/A'降低均明顯增加(p＜0.05～p＜0.01)，LVEDd明顯降低(p＜0.01)。
　　NLRP3基因沉默改善DCM心肌重構(gòu)
　　與control組比較，DM組心肌重構(gòu)的特點(diǎn)是:心肌細(xì)胞DNA損傷增多，心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)受損，1型及3型膠原表達(dá)增加，1型及3型膠原比例增高，間質(zhì)纖維化增多，心臟向心性肥厚，心身比增大等。
　　與vehicle組相比，N

28、LRP3基因沉默可明顯改善DCM心肌重構(gòu)，主要表現(xiàn)為:心肌細(xì)胞DNA損傷減少，1型及3型膠原表達(dá)降低，1型及3型膠原比例降低，間質(zhì)纖維化減少，身心比降低等。
　　高糖刺激心肌細(xì)胞NLRP3炎癥小體及IL-1β表達(dá)增高
　　與control組相比，MG或HG刺激24至48小時(shí)，可引起H9c2心肌細(xì)胞NLRP3，ASC，caspase-1及IL-1β的mRNA表達(dá)升高，且此升高呈現(xiàn)糖濃度依賴(lài)性(p＜0.01)。MG或HG刺激心肌

29、細(xì)胞24至48小時(shí)，NLRP3炎癥小體各組分及IL-1βp17的表達(dá)較control組均升高(p＜0.01)。HG刺激時(shí)，NLRP3、ASC及IL-1βp17在36小時(shí)表達(dá)量最高，并持續(xù)到48小時(shí)(p＜0.05)。據(jù)此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，我們選擇HG為刺激條件，36小時(shí)為刺激時(shí)間。與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，與MG、HG滲透壓匹配的甘露醇并不能引起NLRP3炎癥小體及IL-1β表達(dá)升高。
　　高糖刺激誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞caspase-1表達(dá)升高

30、及細(xì)胞焦亡
　　與control及MG組比較，HG組中的caspase-1p20表達(dá)明顯增高(p＜0.05～p＜0.01)。免疫熒光結(jié)果顯示，MG及HG可促進(jìn)caspase-1在心肌細(xì)胞胞質(zhì)中聚集，同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)，與control組相比，心肌細(xì)胞核DNA的損傷及心肌細(xì)胞膜的破壞隨著caspase-1表達(dá)升高而加重(p＜0.01)。
　　NLRP3在高糖引起的細(xì)胞焦亡中發(fā)揮重要的作用
　　我們利用NLRP3-miRNA抑

31、制心肌細(xì)胞內(nèi)NLRP3的表達(dá)，探究NLRP3在心肌焦亡中的作用。在確保病毒轉(zhuǎn)染效率達(dá)80％以上的前提下，NLRP3-miRNA能夠有效抑制靶基因mRNA及蛋白的表達(dá)(p＜0.01)。隨著NLRP3蛋白的抑制，高糖刺激下caspase-1及IL-1β的活性也明顯受到抑制(p＜0.05～p＜0.01)。與此同時(shí)，高糖刺激下心肌細(xì)胞核DNA損傷及細(xì)胞膜受損較之前有明顯的改善(p＜0.05)。
　　NF-kB及TXNIP在ROS刺激NLR

32、P3激活中發(fā)揮重要作用
　　與control組相比，MG及HG組H9c2細(xì)胞ROS生成增多(p＜0.01)。同時(shí)，MG及HG組NF-kBp65磷酸化及TXNIP表達(dá)較control組增多(p＜0.01)。利用NAC預(yù)處理細(xì)胞能夠明顯減少細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生(p＜0.01)。隨著ROS的生成減少，NF-kBp65磷酸化及TXNIP表達(dá)減少，同時(shí)NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspasep20及IL-1βp17的表達(dá)降

33、低(p＜0.01)。
　　研究結(jié)論：
　　(1)糖尿病狀態(tài)下，心肌細(xì)胞焦亡及心肌纖維化促進(jìn)心臟結(jié)構(gòu)和功能異常;
　　(2)在糖尿病早期，心肌組織NLRP3炎癥小體即表達(dá)升高;
　　(3)利用NLRP3-miRNA慢病毒實(shí)施體內(nèi)干預(yù)后，心肌組織NLRP3的表達(dá)被有效抑制;
　　(4)抑制心肌組織NLRP3表達(dá)后，糖尿病引起的心肌結(jié)構(gòu)和功能的異常明顯改善;
　　(5)高糖刺激可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞ROS生成增多，

34、ROS可促進(jìn)NLRP3炎癥小體表達(dá)升高，增高的caspase-1可促進(jìn)心肌細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞焦亡的特征;
　　(6)NF-kB及TXNIP可能介導(dǎo)了ROS促進(jìn)NLRP3炎癥小體表達(dá)增多。
　　第二部分：NLRP3炎癥小體介導(dǎo)瑞舒伐他汀改善糖尿病性心肌病左室重構(gòu)的實(shí)驗(yàn)研究
　　研究背景:
　　糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是以舒張功能顯著受損和收縮功能輕度下降為特征的心肌病變，是

35、糖尿病病人的主要死亡原因之一。既往研究表明，炎癥反應(yīng)在DCM中發(fā)揮著重要作用。因此，對(duì)DCM中炎癥反應(yīng)的相關(guān)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究并尋找相關(guān)治療策略具有重要意義。
　　促炎因子白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)在DCM的發(fā)病過(guò)程中起到非常重要的作用。既往研究表明，IL-1β的激活主要受炎癥小體（inflammasome）調(diào)控。炎癥小體是位于細(xì)胞內(nèi)的一種多聚蛋白復(fù)合體，其家族成員包括:NLRs(nucleotide

36、 binding oligomerization domain-like receptors)家族及AIM2(absent in melanoma 2)家族。NLRP3(NOD like receptor protein 3，NLRP3)是NLRs亞組中的一員。NLRP3炎癥小體由NLRP3，含CARD結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)顆粒樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CAR

37、D，ASC)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartatespecific proteinase-1，caspase-1)組成。近來(lái)有研究表明，NLRP3炎癥小體在糖尿病、糖尿病腎病及糖尿病視網(wǎng)膜病變等疾病的炎癥反應(yīng)中起到非常重要的作用。此外，在高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)中，NLRP3炎癥小體通過(guò)與硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting/inhibiting protein，TXN

38、IP)直接結(jié)合而被激活，繼而促發(fā)下游的炎癥反應(yīng)。我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NLRP3炎癥小體通過(guò)促進(jìn)炎癥反應(yīng)、心肌損傷及心肌纖維化而加速DCM的發(fā)生和發(fā)展。既往研究表明絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases，MAPKs)在DCM的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。
　　瑞舒伐他汀是一種HMG-CoA還原酶抑制劑。研究顯示，瑞舒伐他汀除了具有調(diào)脂作用外，還具有抗炎、抗氧化及逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)的作用。在心肌

39、肥厚、心肌梗死及實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎的動(dòng)物模型中，瑞舒伐他汀的心臟保護(hù)作用已經(jīng)得到證實(shí)。但是，具有抗炎作用的瑞舒伐他汀能否影響DCM中異常表達(dá)的NLRP3炎癥小體及MAPKs通路，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。瑞舒伐他汀能否通過(guò)NLRP3炎癥小體及MAPKs通路改善心肌重構(gòu)，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　據(jù)此，本課題擬構(gòu)建DCM大鼠模型，并研究瑞舒伐他汀在DCM發(fā)生、發(fā)展中的作用，探討瑞舒伐他汀是否通過(guò)調(diào)控NLRP3炎癥小體及MAPKs通路發(fā)揮心肌保

40、護(hù)作用，進(jìn)一步研究NLRP3炎癥小體在DCM中潛在臨床價(jià)值。
　　研究目的:
　　(1)建立DCM大鼠模型，探討RSV在DCM進(jìn)展中的作用;
　　(2)探討NLRP3炎癥小體及MAPKs通路在RSV對(duì)DCM大鼠心肌保護(hù)過(guò)程中的作用;
　　(3)探討RSV抑制NLRP3炎癥小體的可能機(jī)制。
　　研究方法:
　　2型糖尿病大鼠模型
　　選擇105只健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠（山

41、東省中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），平均體重為100-120g。將大鼠隨機(jī)分為7組:對(duì)照組（control組），高脂飲食組（HF組），糖尿病組（DM組），高脂飲食+瑞舒伐他汀10mg/kg組(HF+RSV10mg/kg組)，高脂飲食+瑞舒伐他汀15mg/kg組（HF+RSV15mg/kg組），糖尿病+瑞舒伐他汀10mg/kg組(DM+RSV10mg/kg組)，糖尿病+瑞舒伐他汀15mg/kg組(DM+RSV15mg/kg組)。Control組

42、給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，主要成分為:5％脂質(zhì)，不添加膽固醇。其余6組給予高脂飲食喂養(yǎng)，主要成分為:16％脂質(zhì)，0.25％膽固醇。4周后7組大鼠均行腹腔葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(IPGTT)及腹腔胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(IPITT)。DM組、DM+RSV10mg/kg組及DM+RSV15mg/kg組出現(xiàn)胰島素抵抗的大鼠接受單次腹腔STZ注射，劑量為35mg/kg。1周后，檢測(cè)DM組、DM+RSV10mg/kg組及DM+RSV15mg/kg組大鼠的空腹血糖(BG)

43、及胰島素(INS)，計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(ISI)，ISI=In[(INS×BG)-1]。連續(xù)兩次空腹血糖≥11.1mmol/L，且存在胰島素抵抗則認(rèn)為2型糖尿病造模成功。在行STZ腹腔注射8周后，HF+RSV10mg/kg組、HF+RSV15mg/kg、DM+RSV10mg/kg組及DM+RSV15mg/kg分別給予瑞舒伐他汀干預(yù)8周。瑞舒伐他汀干預(yù)8周后，7組大鼠均實(shí)施安樂(lè)死。
　　糖尿病性心肌病模型
　　糖尿病大鼠造模成

44、功后，繼續(xù)給予高脂喂養(yǎng)。至STZ注射后8周，檢測(cè)大鼠心功能，糖尿病大鼠出現(xiàn)左室舒張功能障礙則提示開(kāi)始進(jìn)展為DCM。至STZ注射后16周，檢測(cè)大鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能，糖尿病大鼠心臟組織呈現(xiàn)心肌間質(zhì)纖維化及左室肥厚的，并出現(xiàn)左室收縮及舒張功能障礙，則提示DCM模型已經(jīng)成功建立。
　　基因沉默技術(shù)
　　根據(jù)RNAi干擾技術(shù)的原則，設(shè)計(jì)4對(duì)針對(duì)大鼠NLRP3基因的miRNA片段，并分別構(gòu)建4對(duì)pcDNA6.2-GW/EmGFP-NLRP

45、3-miRNA質(zhì)粒，經(jīng)篩選后，選擇沉默效率最高的質(zhì)粒，隨后構(gòu)建pDONR221-EmGFP-NLRP3-miRNA重組穿梭質(zhì)粒，最終構(gòu)建pLenti6.3-EmGFP-NLRP3-miRNA慢病毒載體。
　　大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)染慢病毒載體
　　選擇90只健康雄性SD大鼠（山東省中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），平均體重為100-120g。將大鼠隨機(jī)分為6組:對(duì)照組+空載體組（control+vehicle組），糖尿病組+空載體組（DM+ve

46、hicle組），糖尿病+瑞舒伐他汀15mg/kg+空載體組(DM+RSV15mg/kg+vehicle組)，對(duì)照組+NLRP3-miRNA慢病毒干擾組（control+NLRP3-miRNA組），糖尿病組+NLRP3-miRNA慢病毒干擾組(DM+NLRP3-miRNA組)，糖尿病+瑞舒伐他汀15mg/kg+NLRP3-miRNA慢病毒干擾組(DM+RSV15mg/kg+NLRP3-miRNA組)。于STZ注射8周后，分別給予6組大鼠v

47、ehicle或NLRP3-miRNA慢病毒行體內(nèi)干預(yù)，同時(shí)還需給予DM+RSV15mg/kg+vehicle組及DM+RSV15mg/kg+NLRP3-miRNA組大鼠瑞舒伐他汀干預(yù)，慢病毒及瑞舒伐他汀的干預(yù)時(shí)間均為8周，慢病毒注射劑量為1×108TU/只。干預(yù)8周后給予大鼠安樂(lè)死，心臟取材后行冰凍切片，檢測(cè)心肌內(nèi)病毒轉(zhuǎn)染效率。
　　血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)
　　于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，行血清學(xué)檢測(cè)。大鼠禁食禁水12小時(shí)后，取外周靜脈血。檢測(cè)血

48、糖(bloodglucose，BG)、血清甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(totalcholesterol，TC)、胰島素(INS)，并計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(ISI)。
　　心臟彩超
　　大鼠經(jīng)10％水合氯醛麻醉后，行經(jīng)胸心臟彩超，收集LVEF、F/S、E/A以及E'/A'等數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)大鼠左室功能。
　　心肌纖維化
　　對(duì)左室心肌組織行Masson染色、天狼猩紅染色，使用圖像分析軟件對(duì)染色結(jié)果進(jìn)

49、行分析，評(píng)價(jià)左室心肌纖維化程度。
　　透射電鏡
　　大鼠行安樂(lè)死后，立即心臟取材，于左室壁上取1mm3小組織塊，立即放入戊二醛固定液中，為透射電鏡下觀(guān)察左室心肌超微結(jié)構(gòu)做準(zhǔn)備。
　　實(shí)時(shí)定量PCR
　　取新鮮左室心肌組織，通過(guò)實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)檢測(cè)TXNIP、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、collagenⅠ及collagenⅢ的mRNA相對(duì)表達(dá)量。
　　Westernblot檢測(cè)<

50、br>　　取新鮮左室心肌組織，提取蛋白，利用Westernblot檢測(cè)心肌組織內(nèi)TXNIIP、NLRP3、ASC、活化與非活化的caspase-1、活化的IL-1β及磷酸化和非磷酸化的ERK1/2、p38、JNK的蛋白表達(dá)量。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　利用SPSSv18.0處理數(shù)據(jù)，連續(xù)變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤來(lái)表示。利用單因素方差分析和Tukey-Kramerposthoc檢驗(yàn)比較多組間的連續(xù)型變量。利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組間的連

51、續(xù)變量。當(dāng)p＜0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果:
　　高脂飲食4周可誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)胰島素抵抗
　　IPGTT結(jié)果顯示，與基礎(chǔ)飲食相比，高脂喂養(yǎng)大鼠4周后，在IPGTT的0min、30min、60min、120min的血糖值均明顯升高(p＜0.05～p＜0.01);血糖曲線(xiàn)下面積(AUC)明顯增大(p＜0.01)。IPITT的結(jié)果顯示，與基礎(chǔ)飲食相比，高脂喂養(yǎng)大鼠4周后，在IPITT的0min、30min、60m

52、in、120min的血糖值均明顯升高(p＜0.05～p＜0.01);血糖曲線(xiàn)下面積(AUC)明顯增大(p＜0.01)。
　　瑞舒伐他汀對(duì)糖尿病大鼠血糖及胰島素水平無(wú)明顯影響
　　與Control及HF組大鼠相比，DM組大鼠表現(xiàn)出高血糖、高血脂、低胰島素水平及胰島素敏感性指數(shù)下降等特點(diǎn)(p＜0.01)。與Control組比較，HF也存在代謝異常的情況(p＜0.05～p＜0.01)。
　　與未治療組相比，10mg/kg及1

53、5mg/kg瑞舒伐他汀均能降低DM及HF組的膽固醇水平(p＜0.05)，且15mg/kg瑞舒伐他汀降脂效果優(yōu)于10mg/kg(p＜0.05)。與未用藥組相比，10mg/kg或15mg/kg的瑞舒伐他汀均未能逆轉(zhuǎn)DM組及HF組出現(xiàn)的血糖、甘油三酯及胰島素異常。
　　瑞舒伐他汀改善糖尿病引起的左室功能異常
　　DM組的LVEF、FS、E/A及E'/A'均低于Control組，HF組的E/A及E'/A'均低于Control組(p＜

54、0.05～p＜0.01)。
　　與未治療組相比，15mg/kg瑞舒伐他汀可以提高DM組的LVEF、E/A及E'/A'(p＜0.05)。10mg/kg瑞舒伐他汀可提高DM組的E'/A'(p＜0.05)。
　　瑞舒伐他汀改善糖尿病引起的心肌重構(gòu)
　　與Control組相比，DM組及HF組的心身比(heartweighttobodyweight，HW/BW)均增加(p＜0.05～p＜0.01)。糖尿病誘導(dǎo)心肌間質(zhì)纖維化，促進(jìn)

55、膠原Ⅰ及膠原Ⅲ的mRNA表達(dá)增加，促進(jìn)膠原Ⅰ/Ⅲ的增大。與Control組相比，HF組也呈現(xiàn)心肌纖維化增多、膠原mRNA表達(dá)增加的現(xiàn)象(p＜0.05～p＜0.01)。Control組大鼠左室心肌組織透射電鏡結(jié)果顯示:心肌纖維成對(duì)稱(chēng)性分布，Z線(xiàn)有序排列在肌節(jié)周?chē)?，線(xiàn)粒體規(guī)則分布在肌纖維附近。DM組電鏡結(jié)果顯示:心肌超微結(jié)構(gòu)混亂無(wú)序，部分區(qū)域心肌纖維溶解，Z線(xiàn)退化，線(xiàn)粒體腫脹并出現(xiàn)空泡化，線(xiàn)粒體聚集、融合、內(nèi)部線(xiàn)粒體嵴混亂。HF組電鏡結(jié)果顯

56、示左室心肌組織超微結(jié)構(gòu)亦出現(xiàn)破壞，但破壞程度較DM組輕。
　　與未治療組相比，15mg/kg瑞舒伐他汀可降低DM組的HW/BW、左室纖維化面積、膠原Ⅰ/Ⅲ的表達(dá)量及比例的異常(p＜0.01)。10mg/kg瑞舒伐他汀僅能改善心肌纖維化及膠原Ⅰ的表達(dá)異常(p＜0.05～p＜0.01)。但與未治療組相比，瑞舒伐他汀未能有效改善HF組HW/BW及膠原Ⅰ及Ⅲ的表達(dá)量及比例異常。電鏡結(jié)果顯示，經(jīng)瑞舒伐他汀干預(yù)后，DM組及HF組的左心室心肌組

57、織超微結(jié)構(gòu)較未治療組有明顯改善。
　　瑞舒伐他汀抑制炎癥小體激活
　　我們檢測(cè)不同組別大鼠左室心肌組織中TXNIP、NLRP3、ASC、未活化及活化的caspase-1(pro-caspase-1，caspase-1p20)及IL-1β(IL-1β，IL-1βp17)的mRNA及蛋白的表達(dá)水平。DM組中TXNIP、NLRP3、ASC、caspase-1及IL-1β的mRNA表達(dá)水平均高于control組(p＜0.01)。DM

58、組TXNIP、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1p20及IL-1βp17蛋白表達(dá)水平均高于control組(p＜0.05～p＜0.01)。與control組相比，HF組的TXNIP、NLRP3炎癥小體及IL-1β的mRNA及蛋白表達(dá)量明顯增高(p＜0.05～p＜0.01)。
　　與未治療組比較，15mg/kg瑞舒伐他汀可降低糖尿病引起的TXNIP、NLRP3炎癥小體及IL-1β的mRNA表達(dá)(p＜0

59、.05～p＜0.01)。10mg/kg瑞舒伐他汀也可明顯降低TXNIP及IL-1β的mRNA表達(dá)水平。與未治療組比較，瑞舒伐他汀降低了HF組TXNIP、NLRP3、ASC及IL-1β的mRNA表達(dá)水平(p＜0.05～p＜0.01)。與未治療組相比，15mg/kg瑞舒伐他汀降低糖尿病引起的TXNIP、NLRP3炎癥小體、IL-1βp17蛋白表達(dá)升高(p＜0.05～p＜0.01)。10mg/kg瑞舒伐他汀只降低糖尿病引起的pro-caspa

60、se-1蛋白表達(dá)升高(p＜0.05)。此外，15mg/kg瑞舒伐他汀的對(duì)TXNIP、ASC、pro-caspase-1、caspase-1p20及IL-1βp17蛋白表達(dá)的抑制效果優(yōu)于10mg/kg(p＜0.01)。對(duì)HF組進(jìn)行相同干預(yù)，觀(guān)察到類(lèi)似結(jié)果。
　　瑞舒伐他汀抑制MAPK信號(hào)通路
　　我們檢測(cè)不同組別大鼠左室心肌組織中磷酸化及未磷酸化的ERK1/2，p38及JNK的表達(dá)水平。與對(duì)照組相比，DM及HF組中磷酸化的ER

61、K1/2，p38及JNK表達(dá)升高(p＜0.05～p＜0.01)。與未治療組比較，10mg/kg及15mg/kg均能降低DM組磷酸化的ERK1/2，p38及JNK(p＜0.05～p＜0.01)。此外，15mg/kg瑞舒伐他汀抑制磷酸化的ERK1/2的作用優(yōu)于10mg/kg瑞舒伐他汀。在瑞舒伐他汀干預(yù)的HF組中也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似結(jié)果(p＜0.05～p＜0.01)。
　　檢測(cè)體內(nèi)轉(zhuǎn)染后NLRP3沉默效率
　　行NLRP3-miRNA慢病

62、毒體內(nèi)轉(zhuǎn)染8周后，檢測(cè)心肌組織轉(zhuǎn)染效率。與轉(zhuǎn)染空載體組相比，轉(zhuǎn)染NLRP3-miRNA慢病毒組可明顯抑制大鼠心肌組織中NLRP3的mRNA及蛋白水平的表達(dá)。此外，隨著NLRP3表達(dá)的降低，IL-1βp17的表達(dá)也降低(p＜0.05～p＜0.01)。
　　瑞舒伐他汀通過(guò)抑制NLRP3改善糖尿病引起的心功能損害
　　進(jìn)行8周的病毒干預(yù)后，與空載體組相比，NLRP3-miRNA干預(yù)組能顯著改善糖尿病引起的LVEF、FS、E/A及E

63、'/A'降低(p＜0.05)。此外，與空載體組相比，NLRP3-miRNA干預(yù)組能顯著提高DM+RSV15mg/kg組的E/A及E'/A'(p＜0.05)。
　　在空載體轉(zhuǎn)染的糖尿病大鼠中，給予瑞舒伐他汀干預(yù)能明顯改善心臟的收縮及舒張功能(p＜0.05)。但與空載體組相比，NLRP3-miRNA干預(yù)組中瑞舒伐他汀的這種心臟保護(hù)作用并不明顯。
　　瑞舒伐他汀通過(guò)抑制NLRP3減輕心肌損傷
　　與空載體組相比，NLRP3-

64、miRNA可以降低DM組的心身比、間質(zhì)纖維化、膠原Ⅰ及Ⅲ的mRNA表達(dá)及比例(p＜0.05～p＜0.01)。NLRP3-miRNA還能顯著改善心肌超微結(jié)構(gòu)的損傷，包括逆轉(zhuǎn)降解的Z線(xiàn)、紊亂的心肌纖維、腫脹的線(xiàn)粒體及積聚的脂肪微粒。與空載體聯(lián)合15mg/kg瑞舒伐他汀相比，NLRP3-miRNA聯(lián)合15mg/kg瑞舒伐他汀能更顯著地改善糖尿病引起的心臟結(jié)構(gòu)和功能的改變(p＜0.05～p＜0.01)。
　　瑞舒伐他汀的心肌保護(hù)作用在空載

65、體干預(yù)組中非常明顯，但這種保護(hù)作用在NLRP3-miRNA干預(yù)組中并不明顯。
　　研究結(jié)論:
　　(1)NLRP3炎癥小體介導(dǎo)了瑞舒伐他汀對(duì)DCM的心臟保護(hù)作用;MAPKs通路可能參與了瑞舒伐他汀對(duì)DCM的心臟保護(hù)作用;
　　(2)長(zhǎng)期給予瑞舒伐他汀干預(yù)可劑量依賴(lài)性地改善糖尿病性心肌病左室重構(gòu)及收縮和舒張功能障礙;
　　(3)瑞舒伐他汀的心肌保護(hù)作用包括:抑制心肌炎癥反應(yīng);減輕心肌細(xì)胞的肌纖維紊亂、Z線(xiàn)降解、線(xiàn)粒

66、體腫脹融合及脂質(zhì)沉積等超微結(jié)構(gòu)的破壞;抑制膠原纖維的產(chǎn)生及沉積;
　　(4)TXNIP可能介導(dǎo)了瑞舒伐他汀抑制NLRP3炎癥小體的作用。
　　第三部分：原發(fā)性擴(kuò)張型心肌病患者外周血NLRP3炎癥小體表達(dá)水平與預(yù)后的相關(guān)性研究
　　研究背景：
　　原發(fā)性擴(kuò)張型心肌病(idiopathic dilated cardiomyopathy,IDCM)是一種病因不明，以心肌受累為基礎(chǔ)，以心室擴(kuò)張及收縮功能受損為特點(diǎn)的疾病。

67、IDCM是繼冠狀動(dòng)脈疾病及高血壓疾病之后，引起心功能衰竭的第三大常見(jiàn)疾病。臨床資料顯示，IDCM患者通常需要反復(fù)住院治療，部分患者預(yù)后不良。流行病學(xué)資料顯示，IDCM的治療已經(jīng)成為公共衛(wèi)生醫(yī)療系統(tǒng)的負(fù)擔(dān)。因此，尋找與IDCM預(yù)后相關(guān)、并能提供干預(yù)預(yù)警信號(hào)及臨床治療靶點(diǎn)的因子，已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)。
　　雖然IDCM的病因不明，但研究顯示病毒感染、炎癥、自身免疫異常及基因突變均能促進(jìn)IDCM的發(fā)生及發(fā)展。其中，炎癥反應(yīng)在IDCM的

68、病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)是一種重要的促炎因子，其在多種心血管疾病中均表達(dá)上調(diào)。研究顯示，IL-1β的成熟主要受炎癥小體調(diào)控。炎癥小體是一種蛋白復(fù)合物，主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，其家族成員主要包括NLRs（nucleotide binding oligomerization domain-like receptors）家族及AIM2(absent in melanoma 2)家族。NLRP

69、3(NOD like receptor protein 3)是NLRs亞組中的一員。NLRP3炎癥小體由NLRP3、含CARD結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)顆粒樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containingCARD，ASC)及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1，caspase-1)組成。當(dāng)NLRP3炎癥小體在

70、相關(guān)信號(hào)的刺激下形成復(fù)合物之后，pro-caspase-1將會(huì)自我剪切，最終具有活性的caspase-1p10/p20蛋白，活化的caspase-1又可促進(jìn)IL-1β從非活性的前體pro-IL-1β轉(zhuǎn)化成具有活性的IL-β。
　　外周血單核淋巴細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)是血液循環(huán)中NLRP3炎癥小體的主要來(lái)源。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及系統(tǒng)性硬化等疾病中，PBMC

71、s中NLRP3炎癥小體的異常表達(dá)在疾病病程中起到重要的作用。近期的研究顯示，NLRP3炎癥小體在心肌缺血再灌注、急性心肌梗死及心衰等動(dòng)物模型中表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)心肌炎癥損傷及纖維化，最終導(dǎo)致心功能異常。我們的前期結(jié)果表明，NLRP3炎癥小體在糖尿病性心肌病中發(fā)揮重要作用。這些研究提示NLRP3炎癥小體的異常激活與心血管疾病密切相關(guān)，PBMCs中NLRP3炎癥小體的異常激活在疾病的發(fā)展過(guò)程中具有重大意義。但目前，IDCM患者PBMCs中NL

72、RP3炎癥小體的表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)將檢測(cè)IDCM患者PBMCs中NLRP3炎癥小體的表達(dá)水平，并探究IDCM患者體內(nèi)NLRP3炎癥小體表達(dá)水平與患者預(yù)后的相關(guān)性。
　　研究目的：
　　(1)探究NLRP3炎癥小體在IDCM患者PBMCs中的表達(dá)水平;
　　(2)探究NLRP3炎癥小體與IDCM患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性;
　　(3)探究NLRP3炎癥小體在IDCM患者預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值。
　　

73、研究方法：
　　研究對(duì)象
　　連續(xù)收錄就診于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院的IDCM患者54人（IDCM組），收錄健康志愿者20人（Control組）。IDCM患者同時(shí)患有以下疾病者不能納入實(shí)驗(yàn):活動(dòng)期的心肌炎、冠脈疾病、心臟瓣膜病、高血壓、急性或慢性炎癥性疾病、糖尿病、甲狀腺功能異常、痛風(fēng)及類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在患者入院及健康志愿者入組時(shí)開(kāi)始收集臨床資料，主要包括:年齡、性別、血壓、12導(dǎo)聯(lián)心電圖(12-lead electrocardio

74、graphy，ECG)、心臟彩超檢查結(jié)果、紐約心功能分級(jí)(New York Heart Association，NYHA)、血常規(guī)檢查結(jié)果、血清N末端B型腦鈉肽(N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP)檢查結(jié)果等。IDCM患者住院期間均得到規(guī)范治療。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)已通過(guò)山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會(huì)審核。
　　PBMCs分離和純化
　　收集研究對(duì)象的外周血，并分離出血清及

75、PBMCs，分別存于-80℃?zhèn)溆谩?br>　　實(shí)時(shí)定量PCR
　　利用實(shí)時(shí)定量方法檢測(cè)研究對(duì)象PBMCs中NLRP3、ASC、caspase-1及IL-1β的mRNA表達(dá)水平。
　　流式細(xì)胞術(shù)
　　分別利用固定劑和打孔劑處理PBMCs，隨后分別使用NLRP3特異性一抗及帶有FITC的二抗孵育PBMCs，處理完畢后利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PBMCs胞漿中NLRP3的蛋白表達(dá)水平。
　　Western blot
　　

76、從研究對(duì)象PBMCs中提取蛋白，利用westernblot方法檢測(cè)ASC、pro-caspase-1及活化的caspase-1的蛋白表達(dá)。
　　酶聯(lián)免疫反應(yīng)(Enzyme-linked immunosobent assay，ELISA)
　　利用ELISA檢測(cè)研究對(duì)象外周血血清中IL-1β的含量。
　　隨訪(fǎng)
　　IDCM患者從山東大學(xué)齊魯醫(yī)院出院后，將患者因心功能惡化而再入院定為終點(diǎn)事件，對(duì)患者進(jìn)行為期6個(gè)月的隨

77、訪(fǎng)，并記錄IDCM患者的再入院的時(shí)間。
　　統(tǒng)計(jì)分析
　　SPSS18.0用于統(tǒng)計(jì)分析。PASS用于效能計(jì)算。連續(xù)變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，分類(lèi)變量以百分?jǐn)?shù)形式表示。t檢驗(yàn)用于兩組連續(xù)變量間統(tǒng)計(jì)分析。方差分析用于多組連續(xù)變量間統(tǒng)計(jì)分析。卡方檢驗(yàn)用于分類(lèi)變量統(tǒng)計(jì)分析。偏相關(guān)分析用于目標(biāo)因子與臨床指標(biāo)相關(guān)性的統(tǒng)計(jì)分析。Cox回歸分析用于IDCM患者6個(gè)月內(nèi)再入院的影響因素的統(tǒng)計(jì)分析。Kaplan-Meier法用于2組IDCM

78、患者6個(gè)月再入院率的統(tǒng)計(jì)分析，并繪制時(shí)間-效應(yīng)曲線(xiàn)。Log-rank檢驗(yàn)用于比較2組IDCM患者6個(gè)月再入院率的比較。雙側(cè)p＜0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：
　　研究對(duì)象基本信息
　　IDCM組及Control組的臨床資料如表1所示。在所研究的參數(shù)中，僅左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection farction，LVEF）(p＜0.001)、NT-proBNP(p＜0.001)及外

79、周血單核細(xì)胞計(jì)數(shù)(p=0.008)在IDCM組及control組中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　NLRP3炎癥小體及IL-1β在IDCM患者PBMCs中表達(dá)上調(diào)
　　入院24小時(shí)內(nèi)，在未進(jìn)行治療干預(yù)前，IDCM組PBMCs中NLRP3炎癥小體及IL-1βmRNA表達(dá)水平較control組明顯升高（3.50±2.02vs.0.90±0.27，3.54±1.90vs.0.80±0.22，3.82±2.79vs.0.88±0.11，3.9

80、6±2.21vs.0.73±0.25，p＜0.001)。在IDCM組中，出院時(shí)NLRP3、ASC、caspase-1及IL-1β的mRNA水平較入院時(shí)降低（1.74±1.20vs.3.50±2.02，1.81±1.17vs.3.54±1.90，2.19±1.53vs.3.82±2.79，2.20±1.23vs.3.96±2.21，p＜0.001），但仍高于control組（1.74±1.20vs.0.90±0.27，p＜0.05;1.8

81、1±1.17vs.0.80±0.22，p＜0.01;2.19±1.53vs.0.88±0.11,p＜0.01;2.20±1.23vs.0.73±0.25,p＜0.05)。
　　入院24小時(shí)內(nèi)，在未進(jìn)行治療干預(yù)前，IDCM組PBMCs中NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1蛋白表達(dá)水平及血清中IL-1β蛋白表達(dá)水平較control組明顯升高(p＜0.01)。在IDCM組中，出院時(shí)NLRP3、ASC、cas

82、pase-1及IL-1β的蛋白水平較入院時(shí)均降低(p＜0.01)，但仍高于control組(p＜0.01)。在IDCM組中，PBMCs中pro-caspase-1蛋白表達(dá)在入院時(shí)和出院時(shí)的表達(dá)水平未見(jiàn)明顯差異。
　　IDCM患者NLRP3炎癥小體的表達(dá)水平與臨床參數(shù)相關(guān)
　　入院時(shí)，剔除了年齡、性別等影響因素后，IDCM組PBMCs中NLRP3的mRNA水平與LVEF（r=-0.520，p＜0.05）、單核細(xì)胞數(shù)(r=0.6

83、13，p＜0.05)及NT-proBNP水平(r=0.514，p＜0.05)相關(guān)。IDCM組PBMCs中ASC的mRNA水平僅與LVEF（r=-0.334，p＜0.05）及單核細(xì)胞數(shù)(r=0.592，p＜0.05)相關(guān)。
　　NLRP3mRNA表達(dá)水平是IDCM患者6個(gè)月內(nèi)再入院的獨(dú)立危險(xiǎn)因素
　　將IDCM患者出院時(shí)的LVEF及NLRP3、ASC、pro-caspase-1及IL-1β的mRNA表達(dá)水平納入Cox多因素回歸

84、分析模型，結(jié)果顯示:LVEF(RR:0.001，95％置信區(qū)間:0.000-0.128，p＜0.001)，NLRP3mRNA水平(RR:1.643，95％置信區(qū)間:1.193-2.264，p=0.002)，IL-1βmRNA水平（RR:1.512，95％置信區(qū)間:1.131-2.031，p=0.032）是IDCM患者6個(gè)月內(nèi)再入院的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　NLRP3mRNA表達(dá)水平與IDCM預(yù)后相關(guān)
　　在IDCM患者中，出院時(shí)