GM-CSF抑制腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中ZO-1表達(dá)的機(jī)制研究.pdf

1、背景及目的：
　　血腦屏障(The blood-brain barrier, BBB)將中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervoussystem，CNS)與外周血分離開，嚴(yán)格把控化學(xué)物質(zhì)、營養(yǎng)素、外周循環(huán)中的各種細(xì)胞、多肽以及其它多種物質(zhì)進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)，為神經(jīng)元提供了一個(gè)特異的“環(huán)境”。血腦屏障的功能主要依賴于腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Brain microvascular endothelialcells，BMECs)，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間

2、形成緊密連接(Tight junctions，TJs)，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)胞吞作用降低，且一些具有代表性的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白低表達(dá)。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接解聚可以導(dǎo)致跨細(xì)胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)改變、血管生成異常、炎癥反應(yīng)以及腦灌注不足，也參與包括阿爾茲海默癥(Alzheimer'sdisease，AD)、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(Amyotrophic lateral sclerosis)和多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis)在內(nèi)的

3、疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。
　　中樞神經(jīng)中多種細(xì)胞在一些病生理?xiàng)l件下可產(chǎn)生粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF), GM-CSF可以穿過血腦屏障。GM-CSF受體在腦實(shí)質(zhì)中的分布具有廣泛性，包括小膠質(zhì)細(xì)胞、室管膜細(xì)胞、脈絡(luò)叢細(xì)胞、神經(jīng)元以及內(nèi)皮細(xì)胞都表達(dá)GM-CSF受體。所以，有必要關(guān)注病生理狀態(tài)下腦中GM-CSF的多種功能。有意

4、思的是，GM-CSF可以促進(jìn)人外周血單核細(xì)胞穿過血腦屏障，進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)。其中部分機(jī)制在于GM-CSF抑制了腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中緊密連接蛋白ZO-1（Zonula occludens-1，ZO-1）和claudin-5的表達(dá)，從而增加了血腦屏障的通透性。
　　ZO-1是一種細(xì)胞質(zhì)輔助蛋白，具有多種結(jié)構(gòu)域，參與緊密連接的形成。ZO-1及其家族成員將claudin蛋白、occludins和連接黏附分子(Junction adhesionmo

5、lecules，JAMs)在內(nèi)的跨膜蛋白和其它細(xì)胞質(zhì)蛋白以及肌動(dòng)蛋白微絲連接起來。一些研究報(bào)道了ZO-1表達(dá)的影響因素，部分揭示了ZO-1的轉(zhuǎn)錄機(jī)制。人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，腫瘤壞死因子-α和白介素-6可以降低ZO-1的表達(dá)，而過表達(dá)內(nèi)吞蛋白-1(Endophilin-1)則降低了ZO-1的表達(dá)。近來，Chen等人報(bào)道JunD是一種腸上皮細(xì)胞中ZO-1表達(dá)的生物抑制因子，而ZO-1在維持上皮細(xì)胞功能中起到關(guān)鍵作用。然而，各種病生理?xiàng)l件下Z

6、O-1表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制并沒有得到完全揭示。在本次研究中，我們利用多種體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)方法研究了GM-CSF抑制腦內(nèi)皮細(xì)胞中ZO-1轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　一、在體實(shí)驗(yàn)中，GM-CSF對(duì)ZO-1表達(dá)的影響
　　1、小鼠側(cè)腦室注射GM-CSF后48h，組織免疫熒光染色和Western blot檢測(cè)紋狀體微血管中ZO-1的表達(dá)變化。
　　二、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中介導(dǎo)GM-CSF抑制ZO-1表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)

7、與驗(yàn)證。
　　1、構(gòu)建包含不同ZO-1啟動(dòng)子片段的pGL3質(zhì)粒，利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)篩選介導(dǎo)GM-CSF抑制ZO-1表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合片段;利用在線軟件Matinspector預(yù)測(cè)ZO-1啟動(dòng)子區(qū)片段-2787-2747上可能結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。
　　2、RNA干擾Erg后，Real-time PCR、Westemblot以及細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)ERG和ZO-1的表達(dá)變化。
　　3、RNA干擾Nfatc1或Nfatc2

8、后，Real-time PCR和Western blot檢測(cè)NFATC1、NFATC2以及ZO-1的表達(dá)變化。
　　4、構(gòu)建包含不同ZO-1啟動(dòng)子片段的pGL3質(zhì)粒，利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)篩選與ERG共同促進(jìn)ZO-1表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合片段;利用在線軟件Matinspector預(yù)測(cè)ZO-1啟動(dòng)子區(qū)片段-43--1上可能結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。
　　5、RNA干擾c-Myc后，Real-time PCR、Western blot以及細(xì)

9、胞免疫熒光染色檢測(cè)c-Myc和ZO-1的表達(dá)變化。
　　三、人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄因子ERG和c-MYC合作促進(jìn)ZO-1轉(zhuǎn)錄
　　1、利用ChIP和Re-ChIP技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子ERG和c-MYC是否共同結(jié)合ZO-1啟動(dòng)子區(qū)。
　　2、利用在線軟件STRING(http://string-db.org/)分析ERG、c-MYC以及文獻(xiàn)中報(bào)道的CREB1、JUND、MAX等分子之間是否存在相互作用。
　　四、腦

10、微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，GM-CSF對(duì)miR-96/ERG軸的影響
　　1、利用Real-time PCR和Western blot分別檢測(cè)GM-CSF對(duì)HBMECs中轉(zhuǎn)錄因子ERG表達(dá)的影響。
　　2、利用Real-time PCR和Western blot分別檢測(cè)GM-CSF對(duì)HBMECs中轉(zhuǎn)錄因子c-MYC表達(dá)的影響。
　　3、利用在線軟件microRNA.org預(yù)測(cè)抑制Erg表達(dá)的可能miRNAs。
　　4、利

11、用Western blot檢測(cè)高表達(dá)miR-33a、miR-30c、miR-30b和miR-19b2后，HBMECs中轉(zhuǎn)錄因子ERG的表達(dá)變化。
　　5、利用Western blot分別檢測(cè)高表達(dá)或抑制miR-96后HBMECs中轉(zhuǎn)錄因子ERG和ZO-1的表達(dá)變化;構(gòu)建包含野生型和突變型Erg3' UTR的質(zhì)粒，雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)miR-96是否通過預(yù)測(cè)靶點(diǎn)抑制Erg的表達(dá)。
　　五、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，GM-CSF發(fā)揮

12、作用的信號(hào)通路
　　1、利用Real-time PCR檢測(cè)HBMECs中GM-CSF對(duì)miR-96表達(dá)的影響;另外，利用Real-time PCR檢測(cè)不同濃度的PI3K抑制劑BEZ235或AKT抑制劑MK-22062HCL作用下，GM-CSF對(duì)miR-96水平的影響。
　　2、利用Western blot和細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)抑制miR-96水平的同時(shí)，GM-CSF對(duì)轉(zhuǎn)錄因子ERG和ZO-1表達(dá)的影響。
　　六、在體實(shí)

13、驗(yàn)中，驗(yàn)證miR-96介導(dǎo)GM-CSF抑制ZO-1的表達(dá)
　　1、小鼠側(cè)腦室注射miR-96 antagomir-cy3后48 h，組織免疫熒光染色檢測(cè)miR-96 antagomir-cy3在紋狀體內(nèi)的擴(kuò)散情況。
　　2、小鼠側(cè)腦室同時(shí)注射GM-CSF和miR-96 antagomir后48 h，組織免疫熒光染色和Western blot分別檢測(cè)ZO-1的表達(dá)變化。
　　七、GM-CSF通過miR-96/ERG抑制B

14、MECs中ZO-1表達(dá)機(jī)制的工作模式圖。
　　1、繪制工作模式圖。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　一、在體實(shí)驗(yàn)中，GM-CSF對(duì)ZO-1表達(dá)的影響
　　1、組織免疫熒光染色和Western blot結(jié)果顯示，小鼠側(cè)腦室注射GM-CSF后48 h，紋狀體微血管中ZO-1表達(dá)下降。
　　二、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，參與GM-CSF抑制ZO-1表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證。
　　1、ZO-1啟動(dòng)子區(qū)-2787-2747是介

15、導(dǎo)GM-CSF抑制ZO-1表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合區(qū)域。在線軟件Matinspector預(yù)測(cè)結(jié)果顯示ZO-1啟動(dòng)子區(qū)-2787--2747結(jié)合的最可能轉(zhuǎn)錄因子為ERG、NFATC1和NFATC2。
　　2、Real-time PCR和Westem blot結(jié)果顯示siErg-518和siErg-165可以顯著抑制Erg和ZO-1 mRNA以及蛋白的表達(dá);細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示siErg-165可以降低人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中ZO-1的表

16、達(dá)。
　　3、Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示siNfatc1-2543、siNfatc1-2441和siNfate1-2070均可顯著抑制Nfatc mRNA的表達(dá)，但是不影響ZO-1 mRNA或蛋白的表達(dá);同樣，siNfatc2-2036、siNfatc2-1949和siNfatc2-1821均可顯著抑制Nfatc2 mRNA的表達(dá)，但是不影響ZO-1 mRNA或蛋白的表達(dá)。
　　4、啟動(dòng)子區(qū)

17、-43--1參與ZO-1轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在線軟件Matinspector預(yù)測(cè)結(jié)果顯示ZO-1啟動(dòng)子區(qū)-43--1結(jié)合的最可能的轉(zhuǎn)錄因子為c-MYC。
　　5、Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示si-c-Myc-587可顯著降低c-Myc和ZO-1 mRNA以及蛋白的水平;細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示si-c-Myc-587可以降低人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中ZO-1的表達(dá)。
　　三、人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄因子ER

18、G和c-MYC合作促進(jìn)ZO-1轉(zhuǎn)錄
　　1、ChIP結(jié)果顯示轉(zhuǎn)錄因子ERG可以結(jié)合ZO-1啟動(dòng)子區(qū)序列，Re-ChiP結(jié)果顯示ERG和c-MYC相互作用并結(jié)合ZO-1啟動(dòng)子區(qū)序列。
　　2、在線軟件STRING(http://string-db.org/)分析結(jié)果顯示ERG、c-MYC以及文獻(xiàn)中報(bào)道的CREB1、JUND、MAX等分子之間可能形成復(fù)合體，共同參與ZO-1表達(dá)調(diào)控。
　　四、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，GM-CS

19、F對(duì)miR-96/ERG軸的影響
　　1、Real-time PCR結(jié)果顯示，GM-CSF處理HBMECs后24h、48 h，Erg mRNA均顯著下降;Western blot結(jié)果顯示，GM-CSF處理HBMECs后48 h，ERG表達(dá)顯著下降。
　　2、Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示，GM-CSF處理HBMECs后，c-MycmRNA和蛋白均無顯著變化。
　　3、在線軟件microRN

20、A.org預(yù)測(cè)抑制ERG表達(dá)的可能miRNAs，結(jié)果為miR-33a、miR-30c、miR-30b、miR-19b2和miR-96。
　　4、Western blot結(jié)果顯示，HBMECs中高表達(dá)miR-33a、miR-30c、miR-30b和miR-19b2后，轉(zhuǎn)錄因子ERG和ZO-1的表達(dá)均無顯著變化。
　　5、Western blot結(jié)果顯示，HBMECs中高表達(dá)miR-96后，轉(zhuǎn)錄因子ERG和ZO-1表達(dá)均顯著下降

21、;抑制miR-96后，轉(zhuǎn)錄因子ERG蛋白表達(dá)上升，ZO-1表達(dá)顯著上升;雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果顯示miR-96通過結(jié)合預(yù)測(cè)到的Erg3'UTR區(qū)抑制Erg的表達(dá)。
　　五、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，GM-CSF發(fā)揮作用的信號(hào)通路
　　1、Real-time PCR結(jié)果顯示，GM-CSF處理HBMECs后24h、48h后，miR-96表達(dá)均顯著上升;PI3K抑制劑BEZ235和AKT抑制劑MK-22062HCL分別以濃度依賴性的方式

22、降低miR-96的水平。
　　2、Western blot結(jié)果顯示，GM-CSF和miR-96抑制劑同時(shí)處理HBMECs后，GM-CSF不能抑制ERG和ZO-1的表達(dá);細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示，GM-CSF和miR-96抑制劑同時(shí)處理HBMECs后，GM-CSF不能抑制ZO-1的表達(dá)。
　　六、在體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-96介導(dǎo)GM-CSF抑制ZO-1的表達(dá)
　　1、組織免疫熒光染色結(jié)果顯示，小鼠側(cè)腦室注射miR-96 an

23、tagomir-cy3后48 h，miR-96 antagomir-cy3可以擴(kuò)散至紋狀體以及紋狀體中的微血管內(nèi)。
　　2、組織免疫熒光染色和Western blot結(jié)果顯示，小鼠側(cè)腦室同時(shí)注射GM-CSF和miR-96 antagomir后48 h，GM-CSF不能抑制ZO-1的表達(dá)。
　　七、GM-CSF通過miR-96/ERG抑制BMECs中ZO-1表達(dá)機(jī)制的工作模式圖。
　　1、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，GM-CSF