GM-CSF抑制腦微血管內皮細胞中ZO-1表達的機制研究.pdf

1、背景及目的：
　　血腦屏障(The blood-brain barrier, BBB)將中樞神經系統(tǒng)(Central nervoussystem，CNS)與外周血分離開，嚴格把控化學物質、營養(yǎng)素、外周循環(huán)中的各種細胞、多肽以及其它多種物質進入腦實質，為神經元提供了一個特異的“環(huán)境”。血腦屏障的功能主要依賴于腦微血管內皮細胞(Brain microvascular endothelialcells，BMECs)，腦微血管內皮細胞之間

2、形成緊密連接(Tight junctions，TJs)，腦微血管內皮細胞的轉胞吞作用降低，且一些具有代表性的細胞膜轉運蛋白低表達。腦微血管內皮細胞間的緊密連接解聚可以導致跨細胞物質轉運改變、血管生成異常、炎癥反應以及腦灌注不足，也參與包括阿爾茲海默癥(Alzheimer'sdisease，AD)、肌萎縮性脊髓側索硬化癥(Amyotrophic lateral sclerosis)和多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis)在內的

3、疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。
　　中樞神經中多種細胞在一些病生理條件下可產生粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF), GM-CSF可以穿過血腦屏障。GM-CSF受體在腦實質中的分布具有廣泛性，包括小膠質細胞、室管膜細胞、脈絡叢細胞、神經元以及內皮細胞都表達GM-CSF受體。所以，有必要關注病生理狀態(tài)下腦中GM-CSF的多種功能。有意

4、思的是，GM-CSF可以促進人外周血單核細胞穿過血腦屏障，進入腦實質。其中部分機制在于GM-CSF抑制了腦微血管內皮細胞中緊密連接蛋白ZO-1（Zonula occludens-1，ZO-1）和claudin-5的表達，從而增加了血腦屏障的通透性。
　　ZO-1是一種細胞質輔助蛋白，具有多種結構域，參與緊密連接的形成。ZO-1及其家族成員將claudin蛋白、occludins和連接黏附分子(Junction adhesionmo

5、lecules，JAMs)在內的跨膜蛋白和其它細胞質蛋白以及肌動蛋白微絲連接起來。一些研究報道了ZO-1表達的影響因素，部分揭示了ZO-1的轉錄機制。人腦微血管內皮細胞中，腫瘤壞死因子-α和白介素-6可以降低ZO-1的表達，而過表達內吞蛋白-1(Endophilin-1)則降低了ZO-1的表達。近來，Chen等人報道JunD是一種腸上皮細胞中ZO-1表達的生物抑制因子，而ZO-1在維持上皮細胞功能中起到關鍵作用。然而，各種病生理條件下Z

6、O-1表達調控的分子機制并沒有得到完全揭示。在本次研究中，我們利用多種體內和體外實驗方法研究了GM-CSF抑制腦內皮細胞中ZO-1轉錄的分子機制。
　　實驗方法：
　　一、在體實驗中，GM-CSF對ZO-1表達的影響
　　1、小鼠側腦室注射GM-CSF后48h，組織免疫熒光染色和Western blot檢測紋狀體微血管中ZO-1的表達變化。
　　二、腦微血管內皮細胞中介導GM-CSF抑制ZO-1表達的轉錄因子預測

7、與驗證。
　　1、構建包含不同ZO-1啟動子片段的pGL3質粒，利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)篩選介導GM-CSF抑制ZO-1表達的轉錄因子的結合片段;利用在線軟件Matinspector預測ZO-1啟動子區(qū)片段-2787-2747上可能結合的轉錄因子。
　　2、RNA干擾Erg后，Real-time PCR、Westemblot以及細胞免疫熒光染色檢測ERG和ZO-1的表達變化。
　　3、RNA干擾Nfatc1或Nfatc2

8、后，Real-time PCR和Western blot檢測NFATC1、NFATC2以及ZO-1的表達變化。
　　4、構建包含不同ZO-1啟動子片段的pGL3質粒，利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)篩選與ERG共同促進ZO-1表達的轉錄因子的結合片段;利用在線軟件Matinspector預測ZO-1啟動子區(qū)片段-43--1上可能結合的轉錄因子。
　　5、RNA干擾c-Myc后，Real-time PCR、Western blot以及細

9、胞免疫熒光染色檢測c-Myc和ZO-1的表達變化。
　　三、人腦微血管內皮細胞中，轉錄因子ERG和c-MYC合作促進ZO-1轉錄
　　1、利用ChIP和Re-ChIP技術檢測轉錄因子ERG和c-MYC是否共同結合ZO-1啟動子區(qū)。
　　2、利用在線軟件STRING(http://string-db.org/)分析ERG、c-MYC以及文獻中報道的CREB1、JUND、MAX等分子之間是否存在相互作用。
　　四、腦

10、微血管內皮細胞中，GM-CSF對miR-96/ERG軸的影響
　　1、利用Real-time PCR和Western blot分別檢測GM-CSF對HBMECs中轉錄因子ERG表達的影響。
　　2、利用Real-time PCR和Western blot分別檢測GM-CSF對HBMECs中轉錄因子c-MYC表達的影響。
　　3、利用在線軟件microRNA.org預測抑制Erg表達的可能miRNAs。
　　4、利

11、用Western blot檢測高表達miR-33a、miR-30c、miR-30b和miR-19b2后，HBMECs中轉錄因子ERG的表達變化。
　　5、利用Western blot分別檢測高表達或抑制miR-96后HBMECs中轉錄因子ERG和ZO-1的表達變化;構建包含野生型和突變型Erg3' UTR的質粒，雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測miR-96是否通過預測靶點抑制Erg的表達。
　　五、腦微血管內皮細胞中，GM-CSF發(fā)揮

12、作用的信號通路
　　1、利用Real-time PCR檢測HBMECs中GM-CSF對miR-96表達的影響;另外，利用Real-time PCR檢測不同濃度的PI3K抑制劑BEZ235或AKT抑制劑MK-22062HCL作用下，GM-CSF對miR-96水平的影響。
　　2、利用Western blot和細胞免疫熒光染色檢測抑制miR-96水平的同時，GM-CSF對轉錄因子ERG和ZO-1表達的影響。
　　六、在體實

13、驗中，驗證miR-96介導GM-CSF抑制ZO-1的表達
　　1、小鼠側腦室注射miR-96 antagomir-cy3后48 h，組織免疫熒光染色檢測miR-96 antagomir-cy3在紋狀體內的擴散情況。
　　2、小鼠側腦室同時注射GM-CSF和miR-96 antagomir后48 h，組織免疫熒光染色和Western blot分別檢測ZO-1的表達變化。
　　七、GM-CSF通過miR-96/ERG抑制B

14、MECs中ZO-1表達機制的工作模式圖。
　　1、繪制工作模式圖。
　　實驗結果：
　　一、在體實驗中，GM-CSF對ZO-1表達的影響
　　1、組織免疫熒光染色和Western blot結果顯示，小鼠側腦室注射GM-CSF后48 h，紋狀體微血管中ZO-1表達下降。
　　二、腦微血管內皮細胞中，參與GM-CSF抑制ZO-1表達的轉錄因子的預測與驗證。
　　1、ZO-1啟動子區(qū)-2787-2747是介

15、導GM-CSF抑制ZO-1表達的轉錄因子的結合區(qū)域。在線軟件Matinspector預測結果顯示ZO-1啟動子區(qū)-2787--2747結合的最可能轉錄因子為ERG、NFATC1和NFATC2。
　　2、Real-time PCR和Westem blot結果顯示siErg-518和siErg-165可以顯著抑制Erg和ZO-1 mRNA以及蛋白的表達;細胞免疫熒光染色結果顯示siErg-165可以降低人腦微血管內皮細胞中ZO-1的表

16、達。
　　3、Real-time PCR和Western blot結果顯示siNfatc1-2543、siNfatc1-2441和siNfate1-2070均可顯著抑制Nfatc mRNA的表達，但是不影響ZO-1 mRNA或蛋白的表達;同樣，siNfatc2-2036、siNfatc2-1949和siNfatc2-1821均可顯著抑制Nfatc2 mRNA的表達，但是不影響ZO-1 mRNA或蛋白的表達。
　　4、啟動子區(qū)

17、-43--1參與ZO-1轉錄調控。在線軟件Matinspector預測結果顯示ZO-1啟動子區(qū)-43--1結合的最可能的轉錄因子為c-MYC。
　　5、Real-time PCR和Western blot結果顯示si-c-Myc-587可顯著降低c-Myc和ZO-1 mRNA以及蛋白的水平;細胞免疫熒光染色結果顯示si-c-Myc-587可以降低人腦微血管內皮細胞中ZO-1的表達。
　　三、人腦微血管內皮細胞中，轉錄因子ER

18、G和c-MYC合作促進ZO-1轉錄
　　1、ChIP結果顯示轉錄因子ERG可以結合ZO-1啟動子區(qū)序列，Re-ChiP結果顯示ERG和c-MYC相互作用并結合ZO-1啟動子區(qū)序列。
　　2、在線軟件STRING(http://string-db.org/)分析結果顯示ERG、c-MYC以及文獻中報道的CREB1、JUND、MAX等分子之間可能形成復合體，共同參與ZO-1表達調控。
　　四、腦微血管內皮細胞中，GM-CS

19、F對miR-96/ERG軸的影響
　　1、Real-time PCR結果顯示，GM-CSF處理HBMECs后24h、48 h，Erg mRNA均顯著下降;Western blot結果顯示，GM-CSF處理HBMECs后48 h，ERG表達顯著下降。
　　2、Real-time PCR和Western blot結果顯示，GM-CSF處理HBMECs后，c-MycmRNA和蛋白均無顯著變化。
　　3、在線軟件microRN

20、A.org預測抑制ERG表達的可能miRNAs，結果為miR-33a、miR-30c、miR-30b、miR-19b2和miR-96。
　　4、Western blot結果顯示，HBMECs中高表達miR-33a、miR-30c、miR-30b和miR-19b2后，轉錄因子ERG和ZO-1的表達均無顯著變化。
　　5、Western blot結果顯示，HBMECs中高表達miR-96后，轉錄因子ERG和ZO-1表達均顯著下降

21、;抑制miR-96后，轉錄因子ERG蛋白表達上升，ZO-1表達顯著上升;雙熒光素酶報告系統(tǒng)結果顯示miR-96通過結合預測到的Erg3'UTR區(qū)抑制Erg的表達。
　　五、腦微血管內皮細胞中，GM-CSF發(fā)揮作用的信號通路
　　1、Real-time PCR結果顯示，GM-CSF處理HBMECs后24h、48h后，miR-96表達均顯著上升;PI3K抑制劑BEZ235和AKT抑制劑MK-22062HCL分別以濃度依賴性的方式

22、降低miR-96的水平。
　　2、Western blot結果顯示，GM-CSF和miR-96抑制劑同時處理HBMECs后，GM-CSF不能抑制ERG和ZO-1的表達;細胞免疫熒光染色結果顯示，GM-CSF和miR-96抑制劑同時處理HBMECs后，GM-CSF不能抑制ZO-1的表達。
　　六、在體實驗驗證miR-96介導GM-CSF抑制ZO-1的表達
　　1、組織免疫熒光染色結果顯示，小鼠側腦室注射miR-96 an

23、tagomir-cy3后48 h，miR-96 antagomir-cy3可以擴散至紋狀體以及紋狀體中的微血管內。
　　2、組織免疫熒光染色和Western blot結果顯示，小鼠側腦室同時注射GM-CSF和miR-96 antagomir后48 h，GM-CSF不能抑制ZO-1的表達。
　　七、GM-CSF通過miR-96/ERG抑制BMECs中ZO-1表達機制的工作模式圖。
　　1、腦微血管內皮細胞中，GM-CSF