小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞與新生隱球菌GXM作用后基因表達(dá)譜分析.pdf

1、研究背景:全球每年有高達(dá)100萬隱球菌性腦膜腦炎（簡稱隱腦）新發(fā)病例，每年有接近62萬人死于本病，隱球菌病日益受到人們的重視。隱球菌區(qū)別于其他重要醫(yī)學(xué)真菌的特征是具有多糖莢膜，傳統(tǒng)認(rèn)為其胞外多糖組分分為三種:葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖（GXM）、半乳糖木糖甘露聚糖(GalXM)和甘露糖蛋白(MP)。近年來，應(yīng)用血清學(xué)技術(shù)、磁共振技術(shù)和糖組分分析，對隱球菌莢膜的了解逐步加深，不同菌株間GXM的差異致使抗原性的不同，目前基于此新生隱球菌劃分為5

2、種血清型——A、B、C、D和AD型。GXM是隱球菌莢膜多糖最主要的成分，約占莢膜總質(zhì)量的88％。一般認(rèn)為莢膜多糖的毒性作用主要表現(xiàn)在保護(hù)菌體抗吞噬作用和影響宿主免疫防御兩方面。雖然體外實驗有較為充分的證據(jù)，但對于溶解的多糖和細(xì)胞附屬的多糖哪個更具毒性等問題并不清楚。隱球菌病的突出特點在于具有強烈的嗜中樞性，其中九成以上播散性隱球菌感染侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，但這一特征的分子機制目前仍不清楚。一直以來，隱球菌如何通過血-腦脊液屏障的分子機制都是

3、研究者們關(guān)注的熱點和研究的難點。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞三者共同組成血-腦脊液屏障，組成的緊密連接網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能夠有效隔離開血液和腦脊液，嚴(yán)格調(diào)控兩者間物質(zhì)交換。其中，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞是維持血-腦脊液屏障功能最重要的細(xì)胞;與周圍組織內(nèi)皮細(xì)胞間不同點在于，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞具極低胞吞能力、表達(dá)特異肽轉(zhuǎn)運蛋白和離子，毗鄰的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞間形成豐富的緊密連接，形成有效的物理屏障，顯著降低了小分子物質(zhì)的通透。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)隱球菌菌體與腦

4、微血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，能夠引起腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能改變，可能與隱球菌穿透血腦屏障相關(guān)。本研究就莢膜最主要成分GXM對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響進(jìn)行初步的探索。
　　研究目的:探索新生隱球菌GXM能否影響腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞基因的表達(dá)，為進(jìn)一步挖掘隱球菌嗜中樞性的分子機制提供線索、奠定基礎(chǔ)。
　　研究方法:
　　第一部分使用Roche NimbleGen12 x135K小鼠基因表達(dá)譜芯片篩選小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系bEnd.3與

5、不同濃度新生隱球菌GXM作用后差異表達(dá)的基因;結(jié)合基因本體論(GO)，使用標(biāo)準(zhǔn)富集法對差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO分析，進(jìn)行GO項top10排序，推斷所篩選差異基因的功能;結(jié)合GO語義，篩選與隱球菌侵襲中樞神經(jīng)系統(tǒng)能力相關(guān)的差異表達(dá)基因的信息。
　　第二部分對篩選出的重要基因PIK3C2G和ADAMDEC1，采用熒光實時定量PCR對其變化加以驗證。
　　結(jié)果:
　　第一部分對bEnd.3細(xì)胞與新生隱球菌GXM作用前后基因表達(dá)

6、進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，實驗組GXM(90μg/ml)組總共有402個基因表達(dá)上調(diào)，296個基因表達(dá)下調(diào)，GXM(180μg/ml)組總共有421個基因表達(dá)上調(diào)，564個基因表達(dá)下調(diào)。GO項目top10排序提示，新生隱球菌GXM能夠調(diào)節(jié)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)，細(xì)胞緊密連接、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架、細(xì)胞膜成分相關(guān)代謝等GO條目變化顯著。
　　第二部分 PIK3C2G基因和ADAMDEC1基因進(jìn)行熒光定量PCR驗證，結(jié)果與芯片結(jié)果一致，基因表達(dá)水