重組腺病毒缺氧誘導(dǎo)因子-1α基因抗腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧的研究.pdf

1、目的：探討重組腺病毒缺氧誘導(dǎo)因子-1α（Recombinant adenovirus Containing Hypoxia-inducible Factor1αgene，AdHIF-1α）對大鼠腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞（Brain microvascular endothelial cells，BMEC）缺氧損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，為臨床上應(yīng)用基因治療腦缺血奠定一定的理論基礎(chǔ)。
　　方法：體外培養(yǎng)大鼠腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代并傳代，建

2、立BMEC缺氧模型。實(shí)驗(yàn)分為四組即正常對照組，缺氧組，AdHIF-1α基因轉(zhuǎn)染組和重組腺病毒空載體Ad轉(zhuǎn)染組。采用下面的方法分別在大鼠腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧24h后再觀察12h,24h,48h,72h時間點(diǎn)各組HIF-1α，EPO（促紅細(xì)胞生成素Erythropoietin），VEGF（血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子Vasculoar Endothelial Growth Factor）的表達(dá)情況。其中包括：（1）倒置顯微鏡觀察正常BMEC和缺

3、氧BMEC的細(xì)胞形態(tài)和生長情況。（2）在熒光顯微鏡下觀察AdHIF-1α和Ad轉(zhuǎn)染BMEC的情況。（3）逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測BMEC中HIF-1αmRNA,EPOmRNA,VEGFmRNA的表達(dá)。（4）免疫組化檢測 BMEC內(nèi) HIF-1α，VEGF，EPO的蛋白表達(dá)變化。（5）蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測BMEC內(nèi)HIF-1α，VEGF，EPO的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：（1）接種1天后可見大部

4、分微血管段及單個細(xì)胞已經(jīng)貼壁，微血管段邊緣長出單個內(nèi)皮細(xì)胞，呈三角形或長梭形，10-13天融合成片狀，細(xì)胞排列緊密，互不重疊，呈典型的“鋪路亂石樣結(jié)構(gòu)”，即可傳代。經(jīng)Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定，95％以上細(xì)胞的胞漿和核膜周圍被染成棕褐色，證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞。（2）把第三代BMEC培養(yǎng)至第11天，換用含100umol/L Cocl2的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12小時,24小時，48小時發(fā)現(xiàn)缺氧24小時實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ妥钸m合用于

5、本實(shí)驗(yàn)。（3）AdHIF-lα/Ad轉(zhuǎn)染BMEC后，12h開始出現(xiàn)少許熒光，48h熒光表達(dá)最明顯，72小時可見熒光減弱。（4）經(jīng)RT-PCR、免疫組化、Western Blot分別檢測得出Normal組（正常組）HIF-1α，EPO，VEGF就有基礎(chǔ)表達(dá)，Hypoxia組（缺氧組）12h已開始明顯上升，24h有所升高，48h達(dá)高峰，72小時開始下降，并且各時間點(diǎn)的表達(dá)量都比 Normal組的高，兩組相比有顯著性差異（P<0.05，P<0

6、.01）。AdHIF-1α基因治療組各時間點(diǎn)的HIF-1α,EPO,VEGF的表達(dá)比其它組均明顯增加,48小時達(dá)高峰，與Hypoxia組相比均有顯著性差異（P<0.05，P<0.01）。Ad組與Hypoxia組相比無顯著性差異。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)建立的腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)模型及其缺氧模型的建立是成功的，可以作為腦缺血缺氧體外實(shí)驗(yàn)研究的對象；通過本實(shí)驗(yàn)可以得出 AdHIF-1α對大鼠腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用。機(jī)制是外源性