白藜蘆醇抑制缺氧復氧誘導心肌微血管內皮細胞凋亡的作用及機制研究.pdf

1、實驗背景及目的:
　　近幾年來,隨著心血系統(tǒng)疾病治療策略的進步以及溶栓術、血管成形術、冠脈搭橋術和器官移植等方法在臨床的應用,使缺血的心臟組織重新得到血流灌注后,可使心臟結構、功能得到恢復和改善;但有時心臟缺血后再灌注不僅使心臟功能不能恢復,而且造成心肌組織結構和功能障礙進一步加重,甚至發(fā)生不可逆性損傷的現(xiàn)象稱為心肌缺血/再灌注損傷(Myocardiumischemia/reperfusioninjury,MI/RI)。心肌缺血/

2、再灌注損傷可引起心肌細胞膜結構改變、基質中致密物增多,大量的鈣沉積、線粒體水腫、膜通透性改變和細胞器斷裂溶解等超微結構的改變,這些是缺血心肌可逆性損傷向不可逆損傷的病理生理轉變過程。再灌后不但使心肌細胞發(fā)生上述的病理變化,同時導致心肌微血管內皮細胞(Cardiacmicrovascularendothelialcell,CMEC)在形態(tài)、結構和功能發(fā)生異常的病理生理性改變,血管內皮舒張因子(EDRF)減少和內皮素(ET-1)增多,微血管

3、內皮的水腫和破壞,致使血小板與白細胞黏附、聚集、栓塞,造成心肌微血管內皮細胞凋亡(Apoptosis)或壞死。文獻報道,心肌缺血/再灌注損傷時,心肌微血管內皮細胞功能和結構形態(tài)異常改變發(fā)生的時間早于心肌細胞[1],心肌微血管內皮細胞受損引起活性氧物質的生成,釋放細胞因子、生長因子、炎性組織因子、發(fā)生脂質過氧化反應,從而加重內皮細胞損傷、心肌組織結構和功能障礙。
　　白藜蘆醇(Resveratrol)是廣泛存在于葡萄、藜蘆、虎杖等植

4、物中的一種多酚類化合物,具有抗炎、抗氧化、抑制血小板黏附、聚集,調節(jié)能量代謝等生物學保護作用[2]。研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇可抑制缺血缺氧誘導的心肌細胞凋亡、增強心肌組織抵抗損傷的能力,維持氧供需平衡,促進缺血心肌細胞的活力,改善心功能。近期研究證實,磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路可參與缺氧復氧誘導心肌微血管內皮細胞病理生理性損傷的發(fā)生、發(fā)展過程,并調節(jié)細胞存活、增殖分化、細胞遷移和能量代謝等生物學作用[3];

5、缺氧誘導因子-1α(Hypoxiainduciblefactor-1α,HIF-1α)是缺氧環(huán)境下,廣泛存在于人體組織和哺乳動物體內的一種生存轉錄調節(jié)因子,通過調控一系列與適應缺氧有關的基因的表達,促進氧轉運、血管新生、抑制細胞凋亡、生存應激和能量代謝等在保持機體內氧穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要的生理學作用。
　　我們前期研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇可抑制缺氧復氧誘導的心肌細胞凋亡[4],但是缺氧復氧前給予白藜蘆醇干預是否對心肌微血管內皮細胞具有保護作

6、用及其作用機制否是與激活PI3K/Akt/HIF-1α信號通路有關尚未見文獻報道。
　　研究目的:
　　1.觀察不同濃度的白藜蘆醇對缺氧復氧誘導心肌微血管內皮細胞活性和細胞凋亡的影響。
　　2.探討白藜蘆醇抑制缺氧復氧誘導心肌微血管內皮細胞凋亡是否通過激活PI3K/Akt/HIF-1α信號通路而實現(xiàn)的。
　　實驗方法:
　　第一部分:白藜蘆醇預處理對缺氧復氧誘導心肌微血管內皮細胞的影響
　　1.取SD

7、雄性大鼠心臟的左心室心肌,利用酶消化法成功分離心肌微血管內皮細胞(CMEC),Dil-Ac-LDL與DAPI免疫熒光雙染法鑒定細胞。
　　2.建立心肌微血管內皮細胞缺氧復氧模型,設立對照組、缺氧復氧組、不同濃度白藜蘆醇組(5、10、20、30、40μmol/L)。MTT比色法檢測心肌微血管內皮細胞的活性,TUNE染色法檢測心肌微血管內皮細胞凋亡,并確定白藜蘆醇最適實驗濃度。
　　第二部分:PI3K/Akt/HIF-1α信號通

8、路在白藜蘆醇抑制缺氧復氧誘導心肌微血管內皮細胞凋亡中的作用
　　體外培養(yǎng)2-3代的心肌微血管內皮細胞(CMEC),建立缺氧復氧細胞損傷模型,并隨機分為1)對照組2)缺氧復氧(H/R)組3)缺氧復氧(H/R)+20μmol/L白藜蘆醇組4)缺氧復氧(H/R)+20μmol/L白藜蘆醇+LY294002組。MTT比色法檢測心肌微血管內皮細胞的活性;Transwell檢測心肌微血管內皮細胞的遷移能力;分別以PI-AnnexinV、TUN

9、EL染色法檢測心肌微血管內皮細胞凋亡;Western-blot法檢測心肌微血管內皮細胞的P-Akt、HIF-1α蛋白表達水平。
　　實驗結果:
　　1.心肌微血管內皮細胞鑒定:細胞質Dil-Ac-LDL染色陽性(呈紅色熒光),細胞核DAPI染色陽性(呈藍色熒光),證實體外所培養(yǎng)的細胞為心肌微血管內皮細胞(CMEC)。
　　2.MTT、TUNEL法檢測結果表明:不同濃度(5、10、20、30、40μmol/L)白藜蘆醇均

10、可提高細胞活性,抑制細胞凋亡,中濃度的白藜蘆醇(20μmol/L)保護作用明顯(P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義;故選定20μmol/L白藜蘆醇作為最適實驗濃度。3.與對照組相比,缺氧復氧組P-Akt、HIF-1α蛋白表達水平升高(P<0.05);與缺氧復氧組相比,白藜蘆醇組P-Akt、HIF-1α蛋白表達水平明顯升高(P<0.05);與白藜蘆醇組相比,缺氧復氧(H/R)+20μmol/L白藜蘆醇+LY294002組CMEC的活性、遷移

11、能力均明顯降低(P<0.05),細胞凋亡明顯增加(P<0.05),P-Akt、HIF-1α蛋白表達水平明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果表明白藜蘆醇抑制缺氧復氧誘導心肌微血管內皮細胞凋亡可能與Ak磷酸化和上調HIF-1α蛋白表達水平有關。
　　結論:
　　1.不同濃度的白藜蘆醇可增強缺氧復氧誘導心肌微血管內皮細胞的活性、抑制細胞凋亡,而且在一定濃度范圍內具有劑量依賴性。
　　2.白藜蘆醇可抑制心肌微血管內