野薔薇苷對(duì)缺氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及鈣超載的抑制作用及其機(jī)制.pdf

1、目的:研究證實(shí)，藏藥蕨麻具有提高機(jī)體免疫力、抗氧化、耐缺氧、抗疲勞等廣泛生物活性。本課題組前期通過(guò)對(duì)蕨麻進(jìn)行化學(xué)成分研究及藥理活性跟蹤發(fā)現(xiàn)，野薔薇苷（Rosamultin）是蕨麻抗缺血、缺氧的活性成分。但目前關(guān)于野薔薇苷(Rosamultin)抗缺血、缺氧作用的信號(hào)調(diào)控機(jī)制尚不清楚。因此，本工作在文獻(xiàn)報(bào)道及前期研究的基礎(chǔ)上，以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EA.hy926為研究對(duì)象，建立血管內(nèi)皮細(xì)胞的缺氧性損傷模型，觀察野薔薇苷對(duì)缺氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)

2、胞鈣超載及凋亡的抑制作用，并通過(guò)分析鈣超載、缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制及線粒體凋亡通路，探討野薔薇苷抗缺氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣超載及凋亡的分子機(jī)制。
　　方法:
　　1藥物濃度的確定
　　1.1取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞，隨機(jī)分為正常對(duì)照組，缺氧模型組，以及Rosamultin(1×10-6～1×10-14mol/L)處理組，通過(guò)MTT法、LDH活性檢測(cè)，觀察Rosamultin對(duì)EA

3、.hy926內(nèi)皮細(xì)胞缺氧性損傷的保護(hù)作用，確定實(shí)驗(yàn)中Rosamultin的藥物濃度。
　　1.2取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞，隨機(jī)分為正常對(duì)照組，缺氧模型組，以及Verapamil(1×10-6～1×10-14mol/L)處理組，通過(guò)MTT法觀察Verapamil對(duì)EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞缺氧性損傷的保護(hù)作用，確定陽(yáng)性對(duì)照藥的給藥濃度。
　　2 Rosamultin對(duì)人EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞缺氧性損傷的保護(hù)作用<

4、br>　　2.1采用流式細(xì)胞技術(shù)，檢測(cè)各組EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞的活性氧(ROS)水平，觀察Rosamultin對(duì)缺氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的影響。
　　2.2通過(guò)倒置相差顯微鏡、HE染色，觀察Rosamultin對(duì)缺氧條件下EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)變化的影響。
　　2.3通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色觀察Rosamultin對(duì)缺氧條件下EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響
　　3 Rosamultin對(duì)人EA.hy926內(nèi)皮

5、細(xì)胞鈣超載的抑制作用
　　3.1通過(guò)熒光酶標(biāo)儀，檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞中的鈣離子濃度，觀察Rosamultin對(duì)缺氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣超載的影響。
　　3.2通過(guò)激光共聚焦技術(shù)，觀察Rosamultin對(duì)缺氧誘導(dǎo)EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞鈣超載的影響。
　　3.3通過(guò)免疫印跡(Western Blot)技術(shù)，檢測(cè)各組EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞Stim1、Orai1、Calpain1蛋白表達(dá)水平。
　　4

6、 Rosamultin對(duì)人EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的抑制作用
　　4.1通過(guò)Hochest/PI雙染、DAPI染色，從形態(tài)上觀察Rosamultin對(duì)缺氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。
　　4.2通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)（AnnexinⅤ/PI雙染法），檢測(cè)各組EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率，觀察Rosamultin對(duì)缺氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。
　　4.3通過(guò)免疫印跡(Western Blot)技術(shù)，檢測(cè)各組EA.hy

7、926內(nèi)皮細(xì)胞Bax/Bcl-2、Cytc、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表達(dá)水平。
　　5采用免疫熒光法，觀察各組EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞中HIF-1α的核轉(zhuǎn)位情況，探討Rosamultin對(duì)缺氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α活化的影響。
　　6通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immnosorbent assay，ELISA），檢測(cè)各組EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞eNOS以及iNOS的表達(dá)水平。采

8、用酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞NO水平。
　　7通過(guò)免疫印跡(Western Blot)技術(shù)，檢測(cè)各組EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞pVHL、HIF-1α、HIF-1β、VEGH蛋白的表達(dá)水平。
　　8通過(guò)缺氧前加入HIF-1α特異性抑制劑“二甲氧基雌二醇”(2Methoxyestradiol)，觀察Rosamultin抑制缺氧誘導(dǎo)EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1藥物濃度的確

9、定
　　1.1 Rosamultin濃度的確定
　　與正常對(duì)照組相比，缺氧模型組細(xì)胞活力顯著下降，1×10-6 mol/L到1×10-14 mol/L的Rosamultin處理之后，缺氧條件下細(xì)胞活力均顯著上升(P＜0.01)。其中，Rosamultin在1×10-11 mol/L時(shí)其保護(hù)作用最顯著，且在1×10-11 mol/L-1×10-13 mol/L范圍內(nèi)其作用隨濃度降低而趨勢(shì)。
　　與正常對(duì)照組相比，缺氧模型

10、組LDH外漏顯著增高，加入1×10-6mol/L到1×10-14 mol/L的Rosamultin處理均可是缺氧導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞LDH外漏減少(P＜0.01)。其中，Rosamultin在1×10-11 mol/L時(shí)，LDH外漏最少，且在1×10-11 mol/L-1×10-13 mol/L范圍內(nèi)，LDH外漏量隨濃度降低而升高。
　　綜合MTT及LDH檢測(cè)結(jié)果，確定Rosamultin的高中低濃度分別為1×10-11 mol/L、1

11、×10-12 mol/L、1×10-13 mol/L。
　　1.2 Verapamil濃度的確定
　　與正常對(duì)照組相比，缺氧模型組細(xì)胞活力顯著下降，各濃度Verapamil均能在缺氧條件下顯著提高細(xì)胞活力(P＜0.01)。為了與Rosamultin濃度一致，選取1×10-11 mol/L為Verapamil濃度。
　　2 Rosamultin對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用
　　2.1細(xì)胞內(nèi)ROS測(cè)定結(jié)果
　　

12、與正常對(duì)照組相比，缺氧模型組細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯提高(P＜0.01)，野薔薇苷各濃度組（Rosamultin，1×10-11、1×10-12、1×10-13mol/L）均能夠明顯減少缺氧引起的細(xì)胞內(nèi)ROS堆積，降低細(xì)胞內(nèi)ROS的水平(P＜0.01)。
　　2.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查
　　與正常對(duì)照組相比，缺氧模型組細(xì)胞皺縮、脫落。Rosamultin處理組和陽(yáng)性藥組細(xì)胞形態(tài)明顯改善。
　　2.3臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果
　　與正

13、常對(duì)照組相比，缺氧模型組藍(lán)染細(xì)胞顯著增加，細(xì)胞存活率下降，而Rosamultin及Verapamil處理組藍(lán)染細(xì)胞顯著減少，細(xì)胞存活率顯著升高(P＜0.01)。
　　3 Rosamultin對(duì)缺氧所致EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞鈣超載的影響
　　3.1熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果
　　與正常組相比，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)而升高，呈時(shí)間依賴(lài)性。缺氧2h時(shí)，與缺氧損傷組相比，Rosamultin及Verapamil處理之后，細(xì)

14、胞內(nèi)鈣離子濃度顯著降低(P＜0.01)。
　　3.2激光共聚焦檢測(cè)結(jié)果
　　細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)而升高，Rosamultin處理之后，細(xì)胞中熒光強(qiáng)度顯著減弱。
　　3.3鈣離子通道及鈣蛋白酶Western Blot檢測(cè)結(jié)果
　　細(xì)胞內(nèi)Stim1、Orai1、Calpain1蛋白表達(dá)量隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)而增高(P＜0.01)，呈濃度依賴(lài)性;缺氧2h后，與正常對(duì)照組相比，缺氧模型組細(xì)胞內(nèi)Stim1、Orai

15、1、Calpain1均顯著上升(P＜0.01)，Rosamultin處理之后Stim1、Orai1、Calpain1的表達(dá)水平均顯著下降(P＜0.01)。
　　4 Rosamultin對(duì)缺氧所致EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響
　　4.1 Hochest/PI雙染結(jié)果
　　與正常對(duì)照組相比，缺氧模型組中死亡細(xì)胞明顯增多，視野中出現(xiàn)大量被紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞，染色質(zhì)凝集增多，而Rosamultin處理之后，死亡細(xì)胞明顯減

16、少，染色質(zhì)凝集減弱。
　　4.2 DAPI染色結(jié)果
　　與正常對(duì)照組相比，缺氧模型組細(xì)胞核皺縮，著色加深，能看到明顯的棒狀凋亡小體，有的細(xì)胞胞核膨脹，破碎，而Rosamultin處理后，胞核皺縮的狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)。
　　4.3流式細(xì)胞法（AnnexinⅤ/PI雙染法）結(jié)果
　　與正常對(duì)照組相比，缺氧模型組中細(xì)胞凋亡率顯著增加(P＜0.01)，加入野薔薇苷（Rosamultin，1×10-11、1×10-12、1×10

17、-13mol/L）和維拉帕米(Verapamil，1×10-11mol/L)干預(yù)之后，細(xì)胞凋亡率顯著下降(P＜0.01)。
　　4.4 Rosamultin對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的影響
　　與正常對(duì)照組相比，缺氧模型組中細(xì)胞內(nèi)Bax、Cyt c、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達(dá)量明顯增高(P＜0.01)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低(P＜0.01);在加入Rosamultin處理之后Bax、Cyt c、Caspase-9

18、、Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01），Bcl-2表達(dá)增高(P＜0.01)。
　　5細(xì)胞內(nèi)iNOS、eNOS、NO檢測(cè)
　　5.1 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞外iNOS、eNOS含量
　　與正常對(duì)照組相比，缺氧模型組中細(xì)胞內(nèi)iNOS水平顯著升高(P＜0.01)，eNOS水平顯著降低(P＜0.01)。而經(jīng)過(guò)各濃度Rosamultin以及Verapamil處理之后，iNOS的水平顯著降低(P＜0.01)，eNO

19、S的水平顯著提高(P＜0.01)。
　　5.2分光光度法檢測(cè)細(xì)胞外NO含量
　　與正常對(duì)照組相比，缺氧模型組中NO水平顯著降低(P＜0.01)。而經(jīng)過(guò)各濃度Rosamultin以及Verapamil處理之后，NO的水平顯著提高(P＜0.01)。
　　6免疫熒光法觀察細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的核位移結(jié)果
　　正常對(duì)照組，細(xì)胞內(nèi)HIF-1α表達(dá)量很少，細(xì)胞中被FITC標(biāo)記的HIF-1α蛋白極少，熒光微弱，缺氧后細(xì)胞內(nèi)HIF

20、-1α入核并在細(xì)胞中大量表達(dá)，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，加入Rosamultin處理之后，HIF-1α表達(dá)顯著增加，熒光強(qiáng)度與缺氧組相比顯著增強(qiáng)(P＜0.01)。
　　7 Rosamultin對(duì)缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)相關(guān)蛋白的作用
　　與正常對(duì)照組相比，缺氧模型組HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)量明顯增加(P＜0.01)，pVHL表達(dá)量減少(P＜0.01)，HIF-1β表達(dá)量無(wú)明顯變化;加入Rosamultin處理之后HIF-1α、V

21、EGF和pVHL蛋白表達(dá)量與缺氧模型組相比均顯著增加(P＜0.01)，HIF-1β蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。
　　8加入HIF-1α特異性抑制劑二甲氧基雌二醇（2Methoxyestradiol，后面簡(jiǎn)稱(chēng)2ME2）實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　8.1 MTT、細(xì)胞凋亡染色及流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果
　　與正常對(duì)照組相比，2ME2（10μg/L）+Rosamultin(1×10-11mol/L)+缺氧組細(xì)胞活力明顯低于Rosamultin(1×10

22、-11mol/L)+缺氧組(P＜0.01)，但顯著高于缺氧模型組和2ME2(10μg/L)+缺氧組(P＜0.01)，細(xì)胞凋亡染色及流式細(xì)胞檢測(cè)凋亡均與MTT結(jié)果一致。
　　8.2免疫印跡(Western Blot)結(jié)果
　　與正常對(duì)照組相比，缺氧模型組HIF-1α、VEGF蛋白顯著升高，2ME2（10μg/L）+缺氧組HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.01);2ME2(10μg/L)+Rosamultin(1×

23、10-11mol/L)+缺氧組與缺氧模型組相比HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，但VEGF顯著高于2ME2(10μg/L)+缺氧組(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1 Rosamultin能明顯減輕缺氧誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞鈣超載、凋亡，改善細(xì)胞形態(tài)，提高細(xì)胞存活率，對(duì)缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷有明顯的保護(hù)作用。
　　2 Rosamultin可能是通過(guò)抑制鈣池依賴(lài)性鈣離子通道減輕內(nèi)皮細(xì)胞缺氧性鈣超載。
　　3 Rosamu