野薔薇苷對缺氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞凋亡及鈣超載的抑制作用及其機制.pdf

1、目的:研究證實，藏藥蕨麻具有提高機體免疫力、抗氧化、耐缺氧、抗疲勞等廣泛生物活性。本課題組前期通過對蕨麻進行化學(xué)成分研究及藥理活性跟蹤發(fā)現(xiàn)，野薔薇苷（Rosamultin）是蕨麻抗缺血、缺氧的活性成分。但目前關(guān)于野薔薇苷(Rosamultin)抗缺血、缺氧作用的信號調(diào)控機制尚不清楚。因此，本工作在文獻報道及前期研究的基礎(chǔ)上，以人臍靜脈內(nèi)皮細胞株EA.hy926為研究對象，建立血管內(nèi)皮細胞的缺氧性損傷模型，觀察野薔薇苷對缺氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細

2、胞鈣超載及凋亡的抑制作用，并通過分析鈣超載、缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）信號通路調(diào)控機制及線粒體凋亡通路，探討野薔薇苷抗缺氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞鈣超載及凋亡的分子機制。
　　方法:
　　1藥物濃度的確定
　　1.1取對數(shù)生長期的EA.hy926內(nèi)皮細胞，隨機分為正常對照組，缺氧模型組，以及Rosamultin(1×10-6～1×10-14mol/L)處理組，通過MTT法、LDH活性檢測，觀察Rosamultin對EA

3、.hy926內(nèi)皮細胞缺氧性損傷的保護作用，確定實驗中Rosamultin的藥物濃度。
　　1.2取對數(shù)生長期的EA.hy926內(nèi)皮細胞，隨機分為正常對照組，缺氧模型組，以及Verapamil(1×10-6～1×10-14mol/L)處理組，通過MTT法觀察Verapamil對EA.hy926內(nèi)皮細胞缺氧性損傷的保護作用，確定陽性對照藥的給藥濃度。
　　2 Rosamultin對人EA.hy926內(nèi)皮細胞缺氧性損傷的保護作用<

4、br>　　2.1采用流式細胞技術(shù)，檢測各組EA.hy926內(nèi)皮細胞的活性氧(ROS)水平，觀察Rosamultin對缺氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞氧化損傷的影響。
　　2.2通過倒置相差顯微鏡、HE染色，觀察Rosamultin對缺氧條件下EA.hy926內(nèi)皮細胞形態(tài)變化的影響。
　　2.3通過臺盼藍染色觀察Rosamultin對缺氧條件下EA.hy926內(nèi)皮細胞存活率的影響
　　3 Rosamultin對人EA.hy926內(nèi)皮

5、細胞鈣超載的抑制作用
　　3.1通過熒光酶標儀，檢測各實驗組EA.hy926內(nèi)皮細胞中的鈣離子濃度，觀察Rosamultin對缺氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞鈣超載的影響。
　　3.2通過激光共聚焦技術(shù)，觀察Rosamultin對缺氧誘導(dǎo)EA.hy926內(nèi)皮細胞鈣超載的影響。
　　3.3通過免疫印跡(Western Blot)技術(shù)，檢測各組EA.hy926內(nèi)皮細胞Stim1、Orai1、Calpain1蛋白表達水平。
　　4

6、 Rosamultin對人EA.hy926內(nèi)皮細胞凋亡的抑制作用
　　4.1通過Hochest/PI雙染、DAPI染色，從形態(tài)上觀察Rosamultin對缺氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響。
　　4.2通過流式細胞術(shù)（AnnexinⅤ/PI雙染法），檢測各組EA.hy926內(nèi)皮細胞的凋亡率，觀察Rosamultin對缺氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響。
　　4.3通過免疫印跡(Western Blot)技術(shù)，檢測各組EA.hy

7、926內(nèi)皮細胞Bax/Bcl-2、Cytc、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表達水平。
　　5采用免疫熒光法，觀察各組EA.hy926內(nèi)皮細胞中HIF-1α的核轉(zhuǎn)位情況，探討Rosamultin對缺氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞HIF-1α活化的影響。
　　6通過酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme-linked immnosorbent assay，ELISA），檢測各組EA.hy926內(nèi)皮細胞eNOS以及iNOS的表達水平。采

8、用酶檢測試劑盒檢測各組EA.hy926內(nèi)皮細胞NO水平。
　　7通過免疫印跡(Western Blot)技術(shù)，檢測各組EA.hy926內(nèi)皮細胞pVHL、HIF-1α、HIF-1β、VEGH蛋白的表達水平。
　　8通過缺氧前加入HIF-1α特異性抑制劑“二甲氧基雌二醇”(2Methoxyestradiol)，觀察Rosamultin抑制缺氧誘導(dǎo)EA.hy926內(nèi)皮細胞凋亡的分子機制。
　　結(jié)果:
　　1藥物濃度的確

9、定
　　1.1 Rosamultin濃度的確定
　　與正常對照組相比，缺氧模型組細胞活力顯著下降，1×10-6 mol/L到1×10-14 mol/L的Rosamultin處理之后，缺氧條件下細胞活力均顯著上升(P＜0.01)。其中，Rosamultin在1×10-11 mol/L時其保護作用最顯著，且在1×10-11 mol/L-1×10-13 mol/L范圍內(nèi)其作用隨濃度降低而趨勢。
　　與正常對照組相比，缺氧模型

10、組LDH外漏顯著增高，加入1×10-6mol/L到1×10-14 mol/L的Rosamultin處理均可是缺氧導(dǎo)致的內(nèi)皮細胞LDH外漏減少(P＜0.01)。其中，Rosamultin在1×10-11 mol/L時，LDH外漏最少，且在1×10-11 mol/L-1×10-13 mol/L范圍內(nèi)，LDH外漏量隨濃度降低而升高。
　　綜合MTT及LDH檢測結(jié)果，確定Rosamultin的高中低濃度分別為1×10-11 mol/L、1

11、×10-12 mol/L、1×10-13 mol/L。
　　1.2 Verapamil濃度的確定
　　與正常對照組相比，缺氧模型組細胞活力顯著下降，各濃度Verapamil均能在缺氧條件下顯著提高細胞活力(P＜0.01)。為了與Rosamultin濃度一致，選取1×10-11 mol/L為Verapamil濃度。
　　2 Rosamultin對內(nèi)皮細胞缺氧損傷的保護作用
　　2.1細胞內(nèi)ROS測定結(jié)果
　　

12、與正常對照組相比，缺氧模型組細胞內(nèi)ROS水平明顯提高(P＜0.01)，野薔薇苷各濃度組（Rosamultin，1×10-11、1×10-12、1×10-13mol/L）均能夠明顯減少缺氧引起的細胞內(nèi)ROS堆積，降低細胞內(nèi)ROS的水平(P＜0.01)。
　　2.2細胞形態(tài)學(xué)檢查
　　與正常對照組相比，缺氧模型組細胞皺縮、脫落。Rosamultin處理組和陽性藥組細胞形態(tài)明顯改善。
　　2.3臺盼藍染色結(jié)果
　　與正

13、常對照組相比，缺氧模型組藍染細胞顯著增加，細胞存活率下降，而Rosamultin及Verapamil處理組藍染細胞顯著減少，細胞存活率顯著升高(P＜0.01)。
　　3 Rosamultin對缺氧所致EA.hy926內(nèi)皮細胞鈣超載的影響
　　3.1熒光酶標儀檢測結(jié)果
　　與正常組相比，細胞內(nèi)鈣離子濃度隨著缺氧時間延長而升高，呈時間依賴性。缺氧2h時，與缺氧損傷組相比，Rosamultin及Verapamil處理之后，細

14、胞內(nèi)鈣離子濃度顯著降低(P＜0.01)。
　　3.2激光共聚焦檢測結(jié)果
　　細胞內(nèi)鈣離子濃度隨著缺氧時間延長而升高，Rosamultin處理之后，細胞中熒光強度顯著減弱。
　　3.3鈣離子通道及鈣蛋白酶Western Blot檢測結(jié)果
　　細胞內(nèi)Stim1、Orai1、Calpain1蛋白表達量隨著缺氧時間延長而增高(P＜0.01)，呈濃度依賴性;缺氧2h后，與正常對照組相比，缺氧模型組細胞內(nèi)Stim1、Orai

15、1、Calpain1均顯著上升(P＜0.01)，Rosamultin處理之后Stim1、Orai1、Calpain1的表達水平均顯著下降(P＜0.01)。
　　4 Rosamultin對缺氧所致EA.hy926內(nèi)皮細胞凋亡的影響
　　4.1 Hochest/PI雙染結(jié)果
　　與正常對照組相比，缺氧模型組中死亡細胞明顯增多，視野中出現(xiàn)大量被紅色熒光標記的細胞，染色質(zhì)凝集增多，而Rosamultin處理之后，死亡細胞明顯減

16、少，染色質(zhì)凝集減弱。
　　4.2 DAPI染色結(jié)果
　　與正常對照組相比，缺氧模型組細胞核皺縮，著色加深，能看到明顯的棒狀凋亡小體，有的細胞胞核膨脹，破碎，而Rosamultin處理后，胞核皺縮的狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)。
　　4.3流式細胞法（AnnexinⅤ/PI雙染法）結(jié)果
　　與正常對照組相比，缺氧模型組中細胞凋亡率顯著增加(P＜0.01)，加入野薔薇苷（Rosamultin，1×10-11、1×10-12、1×10

17、-13mol/L）和維拉帕米(Verapamil，1×10-11mol/L)干預(yù)之后，細胞凋亡率顯著下降(P＜0.01)。
　　4.4 Rosamultin對凋亡相關(guān)蛋白的影響
　　與正常對照組相比，缺氧模型組中細胞內(nèi)Bax、Cyt c、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達量明顯增高(P＜0.01)，Bcl-2蛋白表達水平降低(P＜0.01);在加入Rosamultin處理之后Bax、Cyt c、Caspase-9

18、、Caspase-3蛋白表達水平明顯降低(P＜0.01），Bcl-2表達增高(P＜0.01)。
　　5細胞內(nèi)iNOS、eNOS、NO檢測
　　5.1 ELISA法檢測細胞外iNOS、eNOS含量
　　與正常對照組相比，缺氧模型組中細胞內(nèi)iNOS水平顯著升高(P＜0.01)，eNOS水平顯著降低(P＜0.01)。而經(jīng)過各濃度Rosamultin以及Verapamil處理之后，iNOS的水平顯著降低(P＜0.01)，eNO

19、S的水平顯著提高(P＜0.01)。
　　5.2分光光度法檢測細胞外NO含量
　　與正常對照組相比，缺氧模型組中NO水平顯著降低(P＜0.01)。而經(jīng)過各濃度Rosamultin以及Verapamil處理之后，NO的水平顯著提高(P＜0.01)。
　　6免疫熒光法觀察細胞內(nèi)HIF-1α的核位移結(jié)果
　　正常對照組，細胞內(nèi)HIF-1α表達量很少，細胞中被FITC標記的HIF-1α蛋白極少，熒光微弱，缺氧后細胞內(nèi)HIF

20、-1α入核并在細胞中大量表達，熒光強度顯著增強，加入Rosamultin處理之后，HIF-1α表達顯著增加，熒光強度與缺氧組相比顯著增強(P＜0.01)。
　　7 Rosamultin對缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)相關(guān)蛋白的作用
　　與正常對照組相比，缺氧模型組HIF-1α和VEGF蛋白表達量明顯增加(P＜0.01)，pVHL表達量減少(P＜0.01)，HIF-1β表達量無明顯變化;加入Rosamultin處理之后HIF-1α、V

21、EGF和pVHL蛋白表達量與缺氧模型組相比均顯著增加(P＜0.01)，HIF-1β蛋白表達無明顯變化。
　　8加入HIF-1α特異性抑制劑二甲氧基雌二醇（2Methoxyestradiol，后面簡稱2ME2）實驗結(jié)果:
　　8.1 MTT、細胞凋亡染色及流式細胞檢測結(jié)果
　　與正常對照組相比，2ME2（10μg/L）+Rosamultin(1×10-11mol/L)+缺氧組細胞活力明顯低于Rosamultin(1×10

22、-11mol/L)+缺氧組(P＜0.01)，但顯著高于缺氧模型組和2ME2(10μg/L)+缺氧組(P＜0.01)，細胞凋亡染色及流式細胞檢測凋亡均與MTT結(jié)果一致。
　　8.2免疫印跡(Western Blot)結(jié)果
　　與正常對照組相比，缺氧模型組HIF-1α、VEGF蛋白顯著升高，2ME2（10μg/L）+缺氧組HIF-1α、VEGF蛋白表達明顯降低(P＜0.01);2ME2(10μg/L)+Rosamultin(1×

23、10-11mol/L)+缺氧組與缺氧模型組相比HIF-1α、VEGF蛋白表達顯著下調(diào)，但VEGF顯著高于2ME2(10μg/L)+缺氧組(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1 Rosamultin能明顯減輕缺氧誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞鈣超載、凋亡，改善細胞形態(tài)，提高細胞存活率，對缺氧誘導(dǎo)的細胞損傷有明顯的保護作用。
　　2 Rosamultin可能是通過抑制鈣池依賴性鈣離子通道減輕內(nèi)皮細胞缺氧性鈣超載。
　　3 Rosamu