野薔薇苷對抗急性低壓缺氧大鼠骨組織損傷作用及機制研究.pdf

1、目的：急性高原疾病，通常又稱為急性高山病（AMS），是在急進高原人群中常見和多發(fā)的一類疾病，其病因是由于急速進入高海拔的低氧環(huán)境所造成的人體多組織器官的病理性損傷和功能學紊亂。近年的研究表明，利用多種藥物防治手段可有效減少AMS的發(fā)病人數，并降低其致殘率與致死率。本課題前期研究發(fā)現，從藏藥蕨麻中提取的有效單體成分“野薔薇苷（Rosamultin）”，在體外多種細胞活性實驗中，具有對抗缺氧誘導細胞損傷的藥理活性。在前期研究基礎上，本課題通

2、過建立大鼠急性低壓缺氧損傷模型，模擬人體急進高原引起的低氧損傷，觀察急性低壓缺氧環(huán)境對大鼠骨組織的形態(tài)、結構及功能的影響，并通過缺氧前進行多濃度梯度的藥物干預，研究單體藥物“野薔薇苷”對抗急性高原低壓缺氧大鼠骨組織損傷的藥理作用，通過檢測大鼠骨組織中成骨細胞的活性及其骨形成功能、破骨細胞的活性及其骨吸收功能，深入探討“野薔薇苷”抗缺氧性骨損傷作用的可能機制，以及為新型抗高原缺氧藥物的研發(fā)提供理論基礎與實驗依據。
　　方法：

3、　　1、實驗分組
　　選用60只體重為（200±20）g的雄性SD實驗大鼠，按照隨機數字表的方法，將其分作以下5個實驗組：正常平原對照組（C組）、急性高原低氧模型組（M組）、野薔薇苷高劑量組（15 mg/kg）（H組）、野薔薇苷低劑量組（5 mg/kg）（L組）、地塞米松陽性藥組（0.36 mg/kg）（D組），每組12只大鼠。
　　2、急性高原低氧模型的建立
　　采用數字化控制的低壓缺氧艙（設置相應的溫度和濕度），通

4、過快速連續(xù)的抽真空處理，使艙內負壓達到模擬海拔的真空度（7000 m海拔，持續(xù)18 h），從而建立大鼠急性高原低壓缺氧損傷模型，并在缺氧處理前進行各劑量藥物的干預，同時將正常平原對照組的大鼠置于艙外同等溫、濕度條件下飼養(yǎng)。
　　3、采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）與生化反應顯色法，測定各實驗組大鼠血漿與骨組織勻漿中的鈣（Ca）、磷（P）含量以及堿性磷酸酶（ALP）的活性。
　　4、通過常規(guī)的蘇木素-伊紅（HE）染色，觀察各組

5、大鼠骨組織的形態(tài)結構；通過特征性的ALP染色、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色，觀察各組大鼠骨組織中成骨細胞與破骨細胞的分化活性。
　　5、采用免疫組織化學染色法，測定各組大鼠骨組織中成骨標志物“骨鈣素”（osteocalcin）、破骨標志物“基質金屬蛋白酶-9”（MMP-9）的表達水平，并觀察骨組織信號調控因子“骨保護素”（OPG）與“核因子κB受體活化因子配基”（RANKL）的表達情況。
　　6、利用Micro-CT機

6、（天津中醫(yī)藥大學分析測試中心提供），對各組大鼠股骨干骺端進行連續(xù)掃描，經三維重建成像后，計算一系列骨組織的微結構指標：包括骨組織密度（BMC）、骨體積分數（BV/TV）、骨小梁的分離度（Tb.Sp）以及骨小梁的數量（Tb.N）。
　　7、利用萬能力學加載試驗機（軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生裝備研究所提供），對各組大鼠股骨組織施加三點彎曲力學加載，觀察其斷裂時的力學特性指標：包括骨組織的斷裂彎曲應力、斷裂彎曲應變及斷裂位移，并計算各組大鼠骨組

7、織的彈性模量。
　　結果：
　　1、血鈣濃度檢測結果
　　相比于正常平原對照組，模擬急性高原缺氧后大鼠的血鈣濃度并無顯著性改變；而相比于急性高原低氧模型組，高、低劑量野薔薇苷干預后大鼠的血鈣濃度顯著升高（P<0.01），陽性藥物地塞米松干預后大鼠的血鈣濃度也顯著升高（P<0.01）。
　　2、血磷濃度檢測結果
　　相比于正常平原對照組，模擬急性高原缺氧后大鼠的血磷濃度顯著升高（P<0.01）；而相比于急性高

8、原低氧模型組，高、低劑量野薔薇苷干預后大鼠的血磷濃度顯著下降（P<0.01或P<0.05），陽性藥物地塞米松干預后大鼠的血磷濃度也顯著下降（P<0.01）。
　　3、血ALP檢測結果
　　相比于正常平原對照組，模擬急性高原缺氧后大鼠血漿中ALP活性無顯著性改變；而相比于急性高原低氧模型組，高劑量野薔薇苷干預后大鼠血漿中ALP活性無顯著性改變，低劑量野薔薇苷干預后大鼠血漿中ALP活性顯著升高（P<0.05），陽性藥物地塞米松干

9、預后大鼠血漿中ALP活性無顯著性改變。
　　4、骨鈣檢測結果
　　相比于正常平原對照組，模擬急性高原缺氧后大鼠的骨鈣濃度并無顯著性改變；而相比于急性高原低氧模型組，經高、低劑量野薔薇苷、陽性藥物地塞米松干預后，大鼠的骨鈣濃度也均無顯著性改變。
　　5、骨磷檢測結果
　　相比于正常平原對照組，模擬急性高原缺氧后大鼠的骨磷濃度并無顯著性改變；相比于急性高原低氧模型組，高、低劑量野薔薇苷干預后大鼠的骨磷濃度也無顯著性改

10、變，而陽性藥物地塞米松干預后大鼠的骨磷濃度顯著下降（P<0.01）。
　　6、骨源性ALP檢測結果
　　相比于正常平原對照組，模擬急性高原缺氧后大鼠骨源性ALP活性顯著下降（P<0.01）；而相比于急性高原低氧模型組，高、低劑量野薔薇苷干預后大鼠骨源性ALP活性顯著升高（P<0.01或P<0.05），陽性藥物地塞米松干預后大鼠骨源性ALP活性也顯著升高（P<0.05）。
　　7、 HE染色結果
　　在正常大鼠的股

11、骨組織中，可見骨小梁邊緣平整光滑，骨小梁排列連續(xù)、緊密，骨小梁分離度較?。幌啾扔谡Ｆ皆瓕φ战M，模擬急性高原缺氧后大鼠股骨組織的骨小梁邊緣粗糙，骨小梁間隙增大，骨小梁排列不齊且有斷點，骨髓腔內炎性細胞增多；而相比于急性高原低氧模型組，高、低劑量野薔薇苷干預后大鼠股骨組織的形態(tài)和結構均有顯著改善，陽性藥物地塞米松干預后大鼠股骨組織的形態(tài)、結構也有明顯改善。
　　8、 ALP染色結果
　　在正常大鼠的股骨組織中，可見ALP染色呈

12、粉紅色，色調均勻且清晰；相比于正常平原對照組，模擬急性高原缺氧后大鼠股骨組織中ALP染色強度降低，色調變淺；而相比于急性高原低氧模型組，高、低劑量野薔薇苷干預后大鼠股骨組織中ALP染色強度顯著升高，其中高劑量野薔薇苷組ALP染色的色調最強，陽性藥物地塞米松干預后大鼠股骨組織中ALP染色強度也有明顯升高。
　　9、 TRAP染色結果
　　在正常大鼠的股骨組織中，較少見到成熟的破骨細胞（呈紫紅色的多核巨細胞）；相比于正常平原對照

13、組，模擬急性高原缺氧后大鼠股骨組織中破骨細胞的數量明顯增多，且多為成熟的分化形態(tài)；而相比于急性高原低氧模型組，高、低劑量野薔薇苷干預后大鼠股骨組織中分化成熟的破骨細胞顯著減少，陽性藥物地塞米松干預后大鼠股骨組織中破骨細胞的分化數量和程度也顯著下降。
　　10、 osteocalcin免疫染色結果
　　相比于正常平原對照組，模擬急性高原缺氧后大鼠骨組織中osteocalcin的表達水平顯著降低（P<0.01）；而相比于急性高原

14、低氧模型組，高、低劑量野薔薇苷干預后大鼠骨組織中osteocalcin的表達水平顯著升高（P<0.01），陽性藥物地塞米松干預后大鼠骨組織中osteocalcin的表達水平也顯著升高（P<0.01）。
　　11、 MMP-9免疫染色結果
　　相比于正常平原對照組，模擬急性高原缺氧后大鼠骨組織中MMP-9的表達水平顯著升高（P<0.05）；而相比于急性高原低氧模型組，高劑量野薔薇苷干預后大鼠骨組織中MMP-9的表達水平顯著降低

15、（P<0.05），陽性藥物地塞米松干預后大鼠骨組織中MMP-9的表達水平也顯著降低（P<0.05）。
　　12、 OPG免疫染色結果
　　相比于正常平原對照組，模擬急性高原缺氧后大鼠骨組織中OPG的表達水平顯著降低（P<0.05）；而相比于急性高原低氧模型組，高、低劑量野薔薇苷干預后大鼠骨組織中OPG的表達水平顯著升高（P<0.01），陽性藥物地塞米松干預后大鼠骨組織中OPG的表達水平也顯著升高（P<0.01）。
　　

16、13、 RANKL免疫染色結果
　　相比于正常平原對照組，模擬急性高原缺氧后大鼠骨組織中RANKL的表達水平顯著升高（P<0.01）；而相比于急性高原低氧模型組，高、低劑量野薔薇苷干預后大鼠骨組織中 RANKL的表達水平顯著降低（P<0.01），陽性藥物地塞米松干預后大鼠骨組織中RANKL的表達水平也顯著降低（P<0.05）。
　　14、 Micro-CT檢測結果
　　相比于正常平原對照組，模擬急性高原缺氧后大鼠股骨干

17、骺端的骨小梁數量顯著減少（P<0.05）；而相比于急性高原低氧模型組，高劑量野薔薇苷干預后大鼠股骨干骺端的骨小梁數量顯著增加（P<0.01），低劑量野薔薇苷及地塞米松干預后大鼠股骨的骨小梁數量無顯著性改變。
　　相比于正常平原對照組，模擬急性高原缺氧后大鼠股骨干骺端的骨小梁分離度顯著增大（P<0.05）；而相比于急性高原低氧模型組，高劑量野薔薇苷干預后大鼠股骨干骺端的骨小梁分離度顯著減小（P<0.01），低劑量野薔薇苷及地塞米松干

18、預后大鼠股骨的骨小梁分離度無顯著性改變。
　　15、骨力學特性檢測結果
　　相比于正常平原對照組，模擬急性高原缺氧后大鼠股骨的斷裂彎曲應力顯著下降（P<0.01）；而相比于急性高原低氧模型組，高、低劑量野薔薇苷干預后大鼠股骨的斷裂彎曲應力顯著升高（P<0.05），陽性藥物地塞米松干預后大鼠股骨的斷裂彎曲應力也顯著升高（P<0.05）。
　　相比正常平原對照組，模擬急性高原缺氧后大鼠股骨的彈性模量顯著下降（P<0.01）

19、；而相比急性高原低氧模型組，高、低劑量野薔薇苷干預后大鼠股骨的彈性模量顯著升高（P<0.05或P<0.01），陽性藥物地塞米松干預后大鼠股骨的彈性模量顯著升高（P<0.01）。
　　結論：野薔薇苷具有明顯的對抗大鼠急性高原低壓缺氧性骨損傷的藥理活性，其機制可能是促進缺氧骨組織中成骨細胞的分化活性，增強其骨形成功能，同時抑制破骨細胞的分化活性，減弱其骨吸收功能，從而調節(jié)骨組織的骨重建過程，改善缺氧骨組織的結構與功能，提高缺氧骨組織的